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詳細(xì)介紹
豬瘟檢測卡|非洲豬瘟檢測試劑盒廠家
【北京康森非洲豬瘟快速檢測試劑盒主要成分與含量】
| 組成 | 組 份 | 規(guī) 格 |
| A盒 | Buffer A | 25 mL/瓶x1瓶 |
| Buffer B | 60 mL/瓶x1瓶 | |
| BufferC | 1250 μL/管x2管 | |
| DNase-Free吸附柱和收集管 | 50套 | |
| B盒 | 熒光PCR反應(yīng)液 | 1000 μL/管x1管 |
| Taq酶 | 30 μL/管x1管 | |
| 陰性對照 | 1000 μL/管x1管 | |
| 陽性對照 | 1000 μL/管x1管 | |
| 說明書 | 1份/盒 |
【北京康森非洲豬瘟快速檢測試劑盒用法與判定】
1.樣品處理
血液樣品直接用,；
淋巴結(jié),、脾臟,、扁桃體樣品,，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品2.0 g于研缽中充分研磨，再加10.0 mL PBS（pH 7.2,，含1萬單位青霉素和1萬單位鏈霉素）混勻（樣品不足2.0 g按1:5比例加PBS）,，對處理的待檢樣品置70℃，30 min滅活后,，3 000 r/min,，4 ℃離心5 min，取上清液,，編號備用,；血球粉處理同上，只不過省掉研磨步驟,。
2.樣品存放
采集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24 h,；若需長期保存，須放置-80 ℃冰箱,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）,。
3.操作步驟
3.1 病毒DNA的提取（使用A盒）
（1）待檢樣品,、陽性對照和陰性對照的份數(shù)總和用n表示,，取n個滅菌的1.5 mL離心管，逐管編號,。
（2）每管加入Buffer A 500 L,。
（3）每管分別加入已處理的待檢樣品、陽性對照,、陰性對照各200 L,，充分混勻，室溫放置10分鐘,。
（4）取與上述離心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管,，編號。將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至DNase-Free吸附柱,，（為避免堵塞吸附柱,，盡量不要吸懸浮雜質(zhì)）,。
（5）13000 r/min室溫離心30 sec。
（6）棄去收集管液體,，將吸附柱放回收集管中,。
（7）吸附柱內(nèi)加入600 μL Buffer B，13000 r/min離心30 sec,。
（8）棄去收集管液體,，將吸附柱放回收集管中。
（9）重復(fù)步驟（7）,，（8）,。
（10）13000 r/min空柱離心2 min，去除殘留液,。
（11）將每個吸附柱分別移入新的1.5mL離心管中,，向柱*加入50 μL Buffer C，室溫靜置1 min,，13000 r/min離心30 sec,，離心管中液體即為模板DNA。獲得的DNA溶液,，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁馓崛〉腄NA須在2 h內(nèi)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,，若需長期保存須放置-80 ℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融）,。
3.2 熒光PCR擴(kuò)增（使用B盒）
（1）從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液,、Taq酶，室溫融化后,，2 000 r/min離心5 sec,。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n = 樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系需要20 μL 熒光PCR反應(yīng)液和0.5 μL Taq酶,。計(jì)算好各試劑的使用量,，加入一適當(dāng)體積小管中，充分混合均勻后,，向每個PCR管中各分裝20 μL,。
（2）分別向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制備的DNA溶液各5μL，蓋緊管蓋,，500 r/min 離心30 sec,。
（3）將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，作好標(biāo)記,。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：
*階段,，預(yù)變性95℃/3 min；第二階段,，95℃/15 sec,，52℃/10 sec,，60℃/35 sec共45個循環(huán)。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的60℃延伸時進(jìn)行,。
4.非洲豬瘟快速檢測試劑盒結(jié)果判定
4.1 結(jié)果分析條件的設(shè)定
閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整,，以閾值線剛好超過陰性對照品擴(kuò)增曲線的高點(diǎn)為準(zhǔn)。對于多通道熒光PCR儀,，選定FAM(465-510)檢測通道讀取檢測結(jié)果,，ABI儀器選擇FAM無熒光淬滅基團(tuán)。
4.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
4.2.1 陰性對照無Ct值并且無擴(kuò)增曲線,。
4.2.2 陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于28,，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。
4.2.3 如陰性和陽性對照不滿足以上條件,，此次實(shí)驗(yàn)視為無效,。
4.3 結(jié)果判定
4.3.1 陰性：無Ct值,，且無特征性擴(kuò)增曲線，表明樣品為陰性,。
4.3.2 陽性：Ct值≤38.0,，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品為陽性,。
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