開發(fā)基于蛋白質的產品需要了解它們在溶液中的表現(xiàn),，而測量樣品的Zeta電位可通過預測聚集行為,，研究蛋白質制劑的穩(wěn)定性。但在實際測量過程中,，Zeta電位明顯變化并不是電場本身導致了蛋白質的聚集,，其變化的真正原因是蛋白質與電極的接觸導致。

本文將介紹一種新的方法：擴散屏障法,，可以提高測量樣品Zeta電位時的準確性和可重復性,。

擴散屏障法通過引入一個較小的樣品量，用溶解蛋白質的相同緩沖液將樣品與電極分離,，因此電極對蛋白質的影響大大降低,。由于這種保護僅由樣品與電極的距離提供,，在樣品擴散到電極之前，樣品都不會受其影響,。而這一過程可能需要數(shù)小時,，因為只測量了可溶性天然蛋白的遷移率，使得樣品的測量結果更加可靠,。

一,、樣品裝載

首先將溶解蛋白質的緩沖液注入折疊毛細管樣品池中。然后將樣品池放入Zetasizer納米粒度電位儀中靜置2至3分鐘,，使其溫度達到平衡,。這將減少任何與溫度有關的流體運動，如對流,。然后取出樣品池,，通過圖1所示的槍頭將20~100 μL的樣品直接注入毛細管樣品池的最底部（圖2）。

圖 1 200μl的凝膠上樣移液槍頭

圖2 折疊毛細管孔中的凝膠移液槍頭,，用于裝載擴散屏障方法的樣品量

圖3 裝樣對比圖：在10 mM NaCl中充滿藍色葡聚糖的樣品池（左）,；樣品池填充10 mM NaCl，并加入50 μl藍色葡聚糖作為擴散屏障（右）

很明顯,，樣品的藍色部分位于樣品池的測量體積中,，距離樣品池頂部的電極有相當大的距離。如果樣品池保持直立并小心處理,，樣品將不會在樣品池內部擴散,。在開始測量之前，應使溫度達到平衡,。

二,、遷移率測量

理論上，使用擴散屏障法進行遷移率測量與在Zetasizer Nano中進行常規(guī)測量相同,。在實際測樣過程中,，離子強度較高的緩沖液會有較高的電導率，導致在給定電壓下焦耳加熱增加,。需要進行一些手動改進,，以提高使用擴散屏障法進行測量的數(shù)據(jù)質量。

為了避免顯著的焦耳熱,，應根據(jù)所使用的緩沖液的導電性來選擇電壓,。如表1所示，在軟件中自動選擇適當?shù)碾妷?，隨著緩沖鹽的濃度增加,，所用的電壓降低，并且運行次數(shù)最多為20次,，以盡量減少焦耳熱,。建議在兩次測量之間設置180秒的延遲,，這也是為了確保測量之間的溫度平衡。

表1：給定濃度緩沖液的建議電壓和最大運行次數(shù)

Zetasizer軟件版本7及以上的蛋白質遷移率測量類型將使所有這些設置自動化,，使測量盡可能簡單。

一,，粒徑分布變化

建議在zeta電位測量之前和之后都進行粒徑測量,，以檢查樣品是否因電位測量而發(fā)生變化。如果遷移率測量影響了樣品并導致其聚集,，這些聚集應該出現(xiàn)在遷移率測量后的尺寸測量數(shù)據(jù)中,。圖4A顯示了在任何遷移率測量之前的粒徑測量示例。該樣本不含聚集體,，PDI為0.05,。在常規(guī)的zeta電位測量后，聚集體已經形成,，PDI接近0.2（圖4B）,。然而，當采用擴散屏障法時,，沒有形成聚集體,，遷移率測量后的PDI仍然低于0.05（圖4C）。

圖4A 樣品遷移率測量前的粒徑分布

圖4B 樣品常規(guī)遷移率測量后的粒徑分布

圖4C 使用擴散屏障法測量遷移率后的粒徑分布

二,、頻率分布的對比

樣品中的聚集體將具有較低的布朗運動速度,，從而在頻率圖中產生一個尖銳的峰值。因此,，頻率圖中出現(xiàn)寬峰是識別高質量數(shù)據(jù)的好方法,。

圖5顯示了蛋白質遷移率測量的兩個頻率圖。圖5A顯示了使用擴散屏障法重復測量的頻率寬峰,，連續(xù)測量的圖重疊良好,，表明沒有聚集物存在。圖5B顯示了未使用擴散屏障法的連續(xù)測量疊加圖,。第一個測量是紅線,，它顯示了廣泛的分布和良好的測量。然而,，隨著測量的進行,，由綠藍線和黑線表示，很明顯,，一個大而尖銳的峰正在形成,，這代表了在測量過程中聚集的樣品。多次測量的圖不一致,，因此無法獲得可重復的遷移率測量,。

圖5A 使用擴散屏障法進行的連續(xù)測量的頻率圖

圖5B：常規(guī)遷移率測量的頻率圖

焦耳熱是測量重復性下降的原因之一,，而通過電導率的測量可以有效識別焦耳熱。為了盡量減少焦耳熱的影響,，電導率應限制在連續(xù)測量之間的增加不超過5-10%,。如果它的增加超過這個值，則表明已經發(fā)生了明顯的加熱,，這可能會影響樣品并降低測量的可重復性,。

至少要進行5次測量，以確保數(shù)據(jù)是可重復的,。在方法開發(fā)過程中,，建議測試一種廉價的替代蛋白質，以優(yōu)化方法,。