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馬爾文帕納科

【熱點應(yīng)用】揭秘蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性,!

時間:2021-9-7 閱讀:3514
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#本文由馬爾文帕納科醫(yī)藥業(yè)務(wù)發(fā)展經(jīng)理 韓佩韋博士供稿#

 

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性研究對于加深對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的了解有著非常重要的意義,。差示掃描量熱技術(shù)(DSC)是直接測量熱轉(zhuǎn)變過程焓變(ΔH的分析方法,,例如蛋白質(zhì),,核酸或其他生物多聚物的熱變性過程,,為表征蛋白質(zhì)及其他生物分子的熱穩(wěn)定性建立“金標(biāo)準(zhǔn)"技術(shù)。

 

一,、焓變對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性意味著什么,?

 

1,什么是焓(hán)變(ΔH),?

 

ΔH(焓變)是在恒壓狀態(tài)下將系統(tǒng)升高至溫度T過程中攝取的總能量,。對于蛋白質(zhì)而言,這意味著用于使蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊所花費(fèi)的能量(熱量),,此過程中 ΔH 是為正值,,代表這是一個吸熱過程。這種能量與蛋白質(zhì)中所有原子和分子運(yùn)動相關(guān),,以及維系蛋白質(zhì)保持折疊構(gòu)象中的鍵能,。

 

通過將吸熱譜圖下方的面積進(jìn)行積分(見圖 1)可以計算得到焓變(ΔH)。焓變用每摩爾蛋白質(zhì)的吸收的卡路里(或焦耳)來表示,。由于蛋白質(zhì)在 DSC 實驗中暴露于升高的溫度,,因此蛋白質(zhì)開始發(fā)生熱變性,并伴隨著非共價鍵的斷裂,。焓變(ΔH)與維系蛋白質(zhì)天然(折疊)構(gòu)象中所需的價鍵數(shù)量有關(guān),。焓變(ΔH)也取決于我們測量總蛋白質(zhì)濃度的準(zhǔn)確程度。如果蛋白質(zhì)濃度不是很準(zhǔn)確, 則會影響到計算出的ΔH值,。

 

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2,,焓變(ΔH)值可以在實踐中告訴我們什么?

 

當(dāng)您比較不同蛋白質(zhì)的DSC結(jié)果時,,具有較大ΔH值的蛋白質(zhì)不一定比具有較小ΔH的蛋白質(zhì)更穩(wěn)定,。由于ΔH值會對蛋白質(zhì)摩爾濃度歸一化,因此該值通常與蛋白質(zhì)的尺寸成比例。大多數(shù)蛋白質(zhì)具有相同的鍵密度(單位體積內(nèi)的價鍵數(shù)量),,因此,,期待具有較大分子量的蛋白質(zhì)也具有較大的焓變(ΔH)值也是合理的。

 

3,,焓變(ΔH)的決定因素是什么,?

 

焓變(ΔH)取決于溶液中天然蛋白質(zhì)的百分比。

 

一個非常重要的考慮是DSC僅測量初始處于折疊(天然)構(gòu)象中的蛋白質(zhì)的ΔH值,。ΔH值取決于具有折疊(活性)構(gòu)象的濃度,。如果初始折疊蛋白質(zhì)組分小于總蛋白質(zhì)濃度(即活性濃度小于100%),則計算出的ΔH值將相應(yīng)地變小,。

 

下圖顯示了在儲存期間的不同時間測量的相同蛋白質(zhì)的DSC圖譜,。藍(lán)色曲線圖譜表示新鮮制備的蛋白質(zhì),是100%天然(折疊)蛋白質(zhì),。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品在儲存期間發(fā)生部分變性時,,溶液中的天然蛋白質(zhì)的比例開始下降,導(dǎo)致DSC圖譜的焓變降低,。當(dāng)我們擁有100%天然蛋白質(zhì)的參考DSC圖譜時,,我們可以根據(jù)不同狀態(tài)樣品的相對ΔH值來估計每個樣品中的折疊蛋白質(zhì)比例。

 

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4,,如何判斷蛋白質(zhì)是否失活,?

 

到目前為止,我們已提及的焓變是指通過DSC儀器直接測量到的“熱"焓,,也就是熱力學(xué)焓變,,通常表示為ΔHcal,這是其他任何非量熱技術(shù),,例如圓二色譜(CD),,表面等離子共振(SPR)等技術(shù)不能獲取的焓變量。

 

還有另一種其他技術(shù)可以獲取的焓變類型,,即范霍夫焓變 - ΔHVH,,我們同樣可以通過DSC數(shù)據(jù)計算得出。范霍夫焓變(ΔHVH)可從通過DSC非兩狀態(tài)模型(non-2-state model)擬合得到,。

 

兩種不同的焓變對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的測定又有什么實際意義呢,?

 

DSC技術(shù)中,ΔHcal僅由DSC熱轉(zhuǎn)變峰曲線積分的面積來確定,,而ΔHVH僅通過熱轉(zhuǎn)變峰曲線的形狀來確定,。轉(zhuǎn)變峰形越尖銳,ΔHVH越大,,反之亦然。ΔHcal是具有濃度依賴性的,但ΔHVH不是,。

 

若ΔHcal/ΔHVH比例為1,,通常意味著所研究的熱轉(zhuǎn)變狀態(tài)符合兩狀態(tài)去折疊(Two-state unfolding model)模型。如果ΔHcal/ΔHVH比例大于1,,則意味著存在顯著密集的中間體存在;  而ΔHcal/ΔHVH比小于1,,則意味著存在分子間相互作用。

 

使用ΔHcal/ΔHVH可以幫我們估測是否有很大部分蛋白質(zhì)是失活的,。如果我們有一個簡單的單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì),,并且假定沒有中間體,則我們可以預(yù)測,,其去折疊過程的ΔHcal/ΔHVH的比值不會遠(yuǎn)離1,。因此,如果ΔHcal顯著低于ΔHVH,,可以表明很大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)失活,。

 

綜上所述,對DSC中ΔH數(shù)據(jù)的分析可以讓我們了解蛋白質(zhì)的去折疊機(jī)制,,以及多少蛋白質(zhì)處于其活性的天然構(gòu)象,。

 

二、TM值如何與和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān),?

 

中點轉(zhuǎn)變溫度TM

我們可以從DSC數(shù)據(jù)中提取多個熱力學(xué)參數(shù),,例如ΔH,ΔHVH(范霍夫焓變),,ΔCP和ΔG,,但*泛使用的參數(shù)是TM。順便提一下,,這也是最容易和最準(zhǔn)確的值 - TM是最大峰值所對應(yīng)的溫度,。

 

 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性"有多種定義。最常見的是,,對于工業(yè)上有重要意義的蛋白質(zhì),,該術(shù)語是指在生理溫度下的功能(或操作)穩(wěn)定性; 即,他們可以在37°C下發(fā)揮多長時間的生物功能,?這可以通過需要花幾天或數(shù)周時間的等溫研究來評估,,或者,如果使用差示掃描量熱法(DSC),,則可以在幾分鐘內(nèi)變性蛋白質(zhì),。

 

通過DSC獲得的哪個熱力學(xué)參數(shù)與功能穩(wěn)定性相關(guān)度最佳?事實證明,,是TM值,。

 

熱力學(xué)穩(wěn)定性(ΔG)是功能穩(wěn)定性的較差的預(yù)測因子; 技術(shù)上,,ΔG僅適用于可逆去折疊過程,此外,,它由TM,,ΔH和ΔCP計算得到,后者可能很難獲取,。

 

一個例子是TM和ΔG與肉桿菌蛋白抗原血清型C的半數(shù)聚集時間(half time)(作為功能穩(wěn)定性的量度)的相關(guān)性,,用作模型蛋白。ΔGT1 / 2 agg. 相關(guān)系數(shù)(R)僅為0.4,,而TM T1 / 2 agg.的相關(guān)系數(shù)是0.92,。(來自J Pharm Sci的數(shù)據(jù),2011 Mar; 1003):836-48

 

思考TM的一種方式:

 

如下圖所示,,假設(shè)我們用 DSC 掃描兩種不同配方中的蛋白質(zhì)或兩種不同的蛋白質(zhì)構(gòu)建體,,則 TM 值向低溫方向 5 的負(fù)偏移(穩(wěn)定性下降)實際上反映了在 37 條件下的 Fu (蛋白去折疊比例)由2%增加到 3%。溫度 T 下的 Fu 蛋白可以通過圖像化的方式估算,,即溫度 T 以下的曲線下陰影區(qū)域面積和整個曲線下方面積的百分比,。

 

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由于聚集體的生成可能是濃度依賴的過程,因此較高濃度的去折疊蛋白質(zhì)(紅色掃描曲線)將導(dǎo)致較快的聚合(更大組分的去折疊狀態(tài)(U)才能轉(zhuǎn)換為不可逆變性狀態(tài)(I),。參見下面的原理圖,。

image.png

 

這種解析的一個推論是,曲線的整體形狀應(yīng)該是相似的,。我們假定這種情況是對于在不同配方中的相同蛋白質(zhì)或由一個母分子衍生出來的具有相似構(gòu)建體的蛋白質(zhì),。但是,對于*不同的蛋白質(zhì),,使用TM值作為用于穩(wěn)定性比較的預(yù)測指標(biāo)則應(yīng)該謹(jǐn)慎使用,。

 

擴(kuò)展閱讀

Differential Scanning Calorimetry (DSC): Theory andpractice

Differential Scanning Calorimetry (DSC) forBiopharmaceutical Development: Versatility and Power

The Power of Heat: Digging Deeper with DifferentialScanning Calorimetry to Study Key Protein Characteristics

 

PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀:DSC

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差式掃描量熱法(DSC)是一種直接分析天然蛋白質(zhì)或其他生物分子熱穩(wěn)定性的技術(shù),無需外在熒光素或者內(nèi)源熒光,,它通過測定在恒定的升溫速率下使生物分子發(fā)生熱變性過程中的熱容變化來實現(xiàn),。

 

馬爾文帕納科 MICROCLA PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀能夠幫助用戶快速確認(rèn)維持高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的最佳條件,提供簡介,、無縫的工作流程和自動化批量數(shù)據(jù)分析,,其所提供的熱穩(wěn)定性信息被業(yè)內(nèi)視為“金標(biāo)準(zhǔn)"技術(shù),是一種非標(biāo)記,、全局性的數(shù)據(jù),。

 

 

關(guān)于馬爾文帕納科

馬爾文帕納科的使命是通過對材料進(jìn)行化學(xué)、物性和結(jié)構(gòu)分析,,打造出客戶導(dǎo)向型創(chuàng)新解決方案和服務(wù),,從而提高效率和產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益。通過利用包括人工智能在內(nèi)的最近技術(shù)發(fā)展,,我們能夠逐步實現(xiàn)這一目標(biāo),。這將讓各個行業(yè)和組織的科學(xué)家和工程師可解決一系列難題,,如提高生產(chǎn)率、開發(fā)更高質(zhì)量的產(chǎn)品,,并縮短產(chǎn)品上市時間,。



 


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