詳細(xì)介紹
高靈敏度脂滴長(zhǎng)時(shí)間成像熒光染料
LipiDye® Ⅱ
LipiDye® II 是一款可用于長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像的高靈敏度優(yōu)質(zhì)脂滴染料試劑,。此外,,它還具有脂滴特異性高、毒性低和光穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn),。適用于以天數(shù)為單位的長(zhǎng)時(shí)間觀察,、脂滴融合和分解過程的活細(xì)胞成像以及使用超高分辨率顯微鏡的超微小脂滴可視化。
LipiDye® II 是LipiDye®(#FDV-0010)的改良版試劑,,關(guān)于LipiDye® 的產(chǎn)品信息,,請(qǐng)復(fù)制http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1262.html查看。
※ 本產(chǎn)品基于名古屋大學(xué) 變革生命分子研究所 山口茂弘教授,、多喜正泰特任準(zhǔn)教授的研究結(jié)果,,由funakoshi株式會(huì)社進(jìn)行商品化并銷售。
※ 本產(chǎn)品僅供研究用,,請(qǐng)勿用于研究以外用途,。
使用LipiDye® II染色脂肪細(xì)胞和非脂肪細(xì)胞的案例
◆關(guān)于脂滴(Lipid droplet)和LipiDye®
脂滴(Lipid droplet)是在脂肪細(xì)胞(Adipocyte)中發(fā)現(xiàn)的大型中性脂肪的結(jié)塊,主要成分是甘油三酯(Triglyceride)和甾醇酯(Sterol Ester)的單分子層結(jié)構(gòu)體(圖1),。脂滴被認(rèn)為是儲(chǔ)存細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)的細(xì)胞器,,并且有較多肥胖和疾病相關(guān)的報(bào)道。最近,,除了脂肪細(xì)胞,,還在肝細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞,、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等各種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了脂滴,。這些發(fā)現(xiàn)明確了其不僅僅是作為中性脂質(zhì)的儲(chǔ)存場(chǎng)所,還有抑制代謝和調(diào)節(jié)基因表達(dá)等各種功能,。對(duì)各種細(xì)胞中的脂滴進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),,非脂肪細(xì)胞的脂滴在1 μm以下,與脂肪細(xì)胞中的10~100 μm的脂滴相比較小(圖2),。因此,,可以利用成像來檢測(cè)活細(xì)胞中非脂肪細(xì)胞的微小脂滴的試劑備受期待,但目前Nile Red等現(xiàn)有試劑會(huì)觀察到脂滴以外的染色試劑(信噪比低),,不適用于活細(xì)胞成像,,觀察微小脂滴僅限于電子顯微鏡觀察。
而LipiDye® 是一款可以顯示高S/N比率的脂滴染色試劑,,雖然檢測(cè)1 μm以下的小脂滴的效果優(yōu)異,,但從光穩(wěn)定性的觀點(diǎn)來看,長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像的效果不佳,。而LipiDye® II 是名古屋大學(xué) 變革生命分子研究所(ITbM)的山口教授,、多喜特任準(zhǔn)教授為了解決上述問題而研發(fā)的新型脂滴檢測(cè)試劑(參考文獻(xiàn)中的名稱為L(zhǎng)AQ1),光穩(wěn)定性非常高,,毒性低,,適合用于長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的活細(xì)胞成像
圖1:脂滴的模式圖及脂肪細(xì)胞(adipocyte)中可見的大型脂滴
圖2:不同細(xì)胞類型中脂滴的成像圖例
◆特點(diǎn)
● 不僅可以選擇性濃縮脂滴,還會(huì)響應(yīng)疏水性環(huán)境而發(fā)出熒光,,因此可以抑制細(xì)胞質(zhì)等的部分發(fā)光,,對(duì)脂滴有著高信噪比(S/N比)
● 可檢測(cè)非脂肪細(xì)胞中的小型脂滴(小于1 μm)
● 光穩(wěn)定性高,長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像效果優(yōu)異
● 由于不會(huì)褪色,,可用于脂滴分解過程中的熒光觀察
● 在推薦的使用濃度(0.1~1 μM)中幾乎不顯示細(xì)胞毒性,。在已添加試劑的狀態(tài)下,脂肪細(xì)胞分化過程的觀察記錄最長(zhǎng)達(dá)8天
● 活細(xì)胞,、固定細(xì)胞都可使用,。也適用于活細(xì)胞染色后再固定處理的情況
● 也適用于STED超高分辨率顯微鏡??捎^察到約200 nm(半峰全寬)的脂滴
◆關(guān)于熒光波長(zhǎng)(激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng))
激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng):400~500 nm/490~600 nm
※ 雖然最大吸收為410~420 nm,,但也可用450~500 nm范圍的光源激發(fā)。詳情請(qǐng)參考下方的激發(fā)/發(fā)射光譜數(shù)據(jù),。
※ 可用800 nm激光進(jìn)行雙光子激發(fā),。詳情請(qǐng)參考下方利用雙光子顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞。
※ 可進(jìn)行多重染色,,但需要注意波長(zhǎng)的選擇,。請(qǐng)使用激發(fā)光在500 nm以上的染料。若使用在450 nm以下的范圍內(nèi)激發(fā)的普通藍(lán)色熒光染料,,可能
※ 會(huì)同時(shí)激發(fā)本試劑,。
■ 光源示例
激發(fā)光 | 405 nm、 445 nm,、 458 nm,、 473 nm、 488 nm*等 |
光源+濾光片 | 可利用一般的FITC或GFP濾片,。 |
STED超高分辨率顯微鏡 | 推薦激發(fā)光:473 nm激光,,STED光:660 nm激光 |
◆LipiDye® 與其他試劑相比的優(yōu)點(diǎn)
試劑名稱 | 顏色 | 激發(fā)光的波長(zhǎng) | 活細(xì)胞的染色 | 固定細(xì)胞的染色 | 光穩(wěn)定性 | 延時(shí)成像 | 多重染色 | S/N比率 |
LipiDye® II | 綠色熒光 | 400~500 nm | 可 | 可 | 非常高 | 超長(zhǎng)時(shí)間 可 | 可(注意波長(zhǎng)的選擇) | 高 |
LipiDye® | 綠色熒光 | 400~470 nm | 可 | 可 | 高 | 短時(shí)間 可 | 可(注意波長(zhǎng)的選擇) | 高 |
Nile Red | 紅色熒光 | ~510 nm | 可 | 可 | 低 | 不適合 | 不適合 | 低 |
熒光染料B | 綠色熒光 | ~480 nm | 可 | 可 | 低 | 可 | 可 | 中 |
脂滴染色試劑A | 紅色和綠色熒光 | —— | 不可 | 可 | 未知 | 不可 | 可 | 高 |
Oil Red O | 紅色染料 | —— | 不可 | 可 | —— | 不可 | —— | 低 |
◆參考文獻(xiàn)
"Fused Thiophene-S,S-dioxide-Based Super-Photostable Fluorescent Marker for Lipid Droplets."
Taki, M., et al., ACS Mater. Lett., 3(1), 42~49 (2021)
◆參考數(shù)據(jù)
激發(fā)/發(fā)射光譜
LipiDye® II是溶劑環(huán)境響應(yīng)型熒光染料(Solvatochromic dye),會(huì)根據(jù)周圍的分子極性改變熒光波長(zhǎng),。吸收光譜幾乎不受溶劑的影響,,可觀察到在380~500 nm的吸收(圖A),。
● 推薦激發(fā)光:405 nm、445 nm,、458 nm,、473 nm激光
● 可使用的激發(fā)光:488 nm激光(由于熒光強(qiáng)度弱,建議根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)使用濃度等進(jìn)行驗(yàn)證,。)
另外,,熒光光譜依賴于溶劑極性,在甲苯和二氯甲烷等疏水性環(huán)境下會(huì)顯示強(qiáng)烈的藍(lán)~綠色熒光,,但在乙腈,、DMSO和水溶液等高極性環(huán)境下,極性越大,,最大熒光就會(huì)轉(zhuǎn)移至長(zhǎng)波長(zhǎng)一側(cè),,對(duì)熒光強(qiáng)度的抑制就越明顯(圖B)。根據(jù)這個(gè)特性,,可觀察到脂滴在疏水性環(huán)境下的特異性綠色熒光,。
用LipiDye® II對(duì)細(xì)胞染色,用顯微鏡光譜掃描脂滴部分,,評(píng)估脂滴的熒光,,約在500 nm附近可觀察到最大的熒光光譜(圖C)。
※ 圖A~圖C的灰色陰影區(qū)域?yàn)橥扑]激發(fā)/熒光波長(zhǎng),。
光穩(wěn)定性
用4%多聚甲醛固定處理3T3-L1脂肪細(xì)胞,,再分別用新產(chǎn)品LipiDye® II、舊款產(chǎn)品LipiDye® 和傳統(tǒng)的熒光染料B染色,,之后使用共聚焦激光顯微鏡反復(fù)進(jìn)行Z-stack成像(激發(fā)473 nm/熒光:490~540 nm),,觀察熒光強(qiáng)度的變化。在Z-stack成像中,,每拍攝一次可獲取10張2 μm的圖像,。傳統(tǒng)染料B經(jīng)過約5次的Z-stack成像后衰減明顯,而相比之下,,舊款產(chǎn)品LipiDye®雖然有耐光性,,但也觀察到了緩慢的衰減,在經(jīng)過50次的Z-stack成像后熒光衰減至60%左右,。
而在本試劑LipiDye® II中,,即使經(jīng)過50次(共計(jì)500次的光照射),其熒光強(qiáng)度也幾乎不發(fā)生變化,。顯示了LipiDye® II具有非常高的光穩(wěn)定性,,適用于長(zhǎng)時(shí)間的延時(shí)成像(包括Z-stack成像)。
細(xì)胞毒性
使用不同濃度的LipiDye® II 處理 3T3-L1脂肪細(xì)胞,,然后使用MTT Assay評(píng)估24 h后的細(xì)胞活性,。本試劑的推薦使用濃度為0.1~1 μM,,但至少在5 μM內(nèi)未觀察到細(xì)胞毒性。在10 μM以上才觀察到細(xì)胞毒性,。
活細(xì)胞和固定細(xì)胞染色
用LipiDye® II對(duì)活細(xì)胞狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細(xì)胞染色,,然后在活細(xì)胞中進(jìn)行熒光觀察(左圖)。之后,,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,清洗后在固定狀態(tài)下再次進(jìn)行熒光觀察(右圖),。固定前后幾乎未觀察到熒光信號(hào)的變化,。表明了本試劑除了可用于活細(xì)胞染色,也可兼容固定細(xì)胞的免疫染色,。
LipiDye®染色的活細(xì)胞和經(jīng)PFA固定后的熒光強(qiáng)度的對(duì)比
◆應(yīng)用數(shù)據(jù)
在各種細(xì)胞中的染色
用LipiDye® II(1 μm)分別染色3T3-L1,、HepG2、COS-7,、HeLa細(xì)胞,,在共聚焦激光顯微鏡下觀察綠色熒光(激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm)(比例尺:20 μm)。在HepG2中,,為使脂滴形成,,用脂肪酸處理了1天。在HeLa細(xì)胞中可清晰地觀察到1 μm以下的小脂滴(參考Hela細(xì)胞放大圖像(右側(cè)),,比例尺:5 μm),。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)標(biāo)記及其多色成像
用LipiDye® II(1 μm)對(duì)表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)駐留紅色熒光蛋白(ER-mKO1)的COS-7細(xì)胞進(jìn)行染色,使用共聚焦激光顯微鏡進(jìn)行熒光觀察(LipiDye® II:激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm,,ER-mKO1:激發(fā)559 nm/熒光570~620 nm),。可以觀察到COS-7細(xì)胞內(nèi)部的小脂滴(<1 μm),,并且大部分駐留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)(參考右側(cè)的放大圖,,比例尺:1 μm)。該結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在脂滴的生物合成,。
長(zhǎng)時(shí)間觀察脂肪細(xì)胞的分化過程
用LipiDye® II在共聚焦激光顯微鏡下觀察活細(xì)胞中誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化為脂肪細(xì)胞時(shí),,成熟脂滴的狀態(tài)8天(激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm)。前2天在含LipiDye® II的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞,,之后每隔兩天更換至含LipiDye® II(1 μm)的維持培養(yǎng)基中,,熒光觀察共計(jì)8天。即使用LipiDye® II進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的處理,,也沒有細(xì)胞毒性和對(duì)脂肪細(xì)胞分化產(chǎn)生影響,,可以觀察到脂滴成熟的過程。
活細(xì)胞成像中新生脂滴的動(dòng)態(tài)行為分析
利用長(zhǎng)時(shí)間延時(shí)成像(Z-stack成像),,觀察在誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化為脂肪細(xì)胞時(shí)新生脂滴的動(dòng)態(tài)行為約24 h(共聚焦激光顯微鏡:激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm,,每10 min拍攝一次,,Z-stack 20張/次)。向預(yù)先已經(jīng)用LipiDye® II染色的前脂肪細(xì)胞中添加分化培養(yǎng)基(含有LipiDye® II),,然后立即開始延時(shí)成像,。分化誘導(dǎo)后約10 h,開始看到小脂滴的出現(xiàn)(650 min,,白色箭頭),,可以觀察到各脂滴在相互作用的同時(shí),不斷成長(zhǎng)的狀態(tài)(950~1450 min,,黃色箭頭),。
觀察脂滴分解·新生過程隨著時(shí)間的變化
向分化誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞中添加腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin(10 μM)和磷酸二酯酶抑制劑IBMX(100 nM),觀察在使用了LipiDye® II的延時(shí)成像(Z-stack)中脂滴隨著三?;视偷姆纸舛s小的過程(共聚焦激光顯微鏡:激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm,,800 min,每4 min拍攝一次,,Z-stack 15張/次),。從圖中可以看到原本的大脂滴(請(qǐng)參見白色箭頭)隨著時(shí)間的推移逐漸變小。另外,,可以看到隨著時(shí)間的推移又產(chǎn)生了許多小脂滴(黃色三角形),。
結(jié)果表明,LipiDye® II具有非常高的光穩(wěn)定性,,無需擔(dān)心褪色,;并有著高信噪比,可以觀察到微小的新生脂滴,,因此可以定量觀察脂滴的增減,。
利用STED超高分辨率顯微鏡可視化微小脂滴
用LipiDye® II(1 μm)染色Hela細(xì)胞,使用激光共聚焦顯微鏡(Confocal)(激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm)和STED超高分辨率顯微鏡(激發(fā)473 nm + STED 660 nm/熒光500~640 nm)對(duì)微小脂滴進(jìn)行觀察,。STED觀察圖像顯示的是經(jīng)過反卷積處理的數(shù)據(jù),。從圖中可以發(fā)現(xiàn)在共聚焦激光顯微鏡下較為模糊的微小脂滴,在STED顯微鏡中非常清晰,,半峰全寬(FWHM)約為120 nm,。
※ 關(guān)于STED顯微鏡的觀察條件及分析方法,請(qǐng)見參考文獻(xiàn),。
利用雙光子顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞
向大鼠原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞中添加LipiDye® II(1 μm),,染色過夜后,用4%PFA固定,,然后在雙光子顯微鏡下進(jìn)行觀察,。可見LipiDye® II使用雙光子激發(fā)法也可以激發(fā),可以檢測(cè)原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞中尺寸各異的脂滴,。
(數(shù)據(jù)提供:Dr. Hyun Beom Choi以及 Dr. Brian MacVicar, The University of British Columbia)
第一代產(chǎn)品復(fù)制http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1262.html查看
◆產(chǎn)品信息
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
FDV-0027 | LipiDye® II ( Live Imaging) LipiDye® II(脂滴活細(xì)胞成像試劑) | 0.1 mg |