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炎癥小體——Caspase-1活化支架
閱讀：2890 發(fā)布時間：2020-2-13
炎癥小體是一種高分子量復合物,，它可以激活炎性胱天蛋白酶并激活I(lǐng)L-1家族細胞因子,。目前已發(fā)現(xiàn)部分NLR家族內(nèi)的炎癥小體，包括NLRP1(NALP1),、NLRP3(NALP3),、IPAF(NLRC4)。
有趣的是,，近發(fā)現(xiàn)的AIM2(黑色素瘤缺乏因子)并不包含在NLR家族內(nèi),。炎癥小體可通過多種信號激活，包括活細菌,、微生物毒素,、異源化合物、PAMPs,、DAMPs,。這表明NLRP3的LRR結(jié)構(gòu)域介導自動阻遏，可能是由SGT1與HSP90分子伴侶通過將NLRP3維持在失活但具備信號功能的狀態(tài),。在檢測到它們各自的配體后,，NLRP1或NLRP3會通過NACHT結(jié)構(gòu)域寡聚化，由于同型PYD-PYD相互作用,，導致PYD聚集和銜接蛋白ASC（含有CARD的細胞凋亡相關(guān)斑點樣蛋白）聚集,。聚集在AIM2的情況下,，寡聚化很可能是通過聚集在dsDNA內(nèi)的多個結(jié)合位點介導的，而并非類似于NACHT那種中央寡聚化結(jié)構(gòu)域介導,。
然而,，AIM2寡聚化同樣也通過同型PYD-PYD相互作用導致ASC聚集。ASC包含一個N末端PYD結(jié)構(gòu)域和一個C末端CARD結(jié)構(gòu)域,，可以通過同型CARD-CARD相互作用聚集炎性胱天蛋白酶,。因此，炎性胱天蛋白酶緊密接近,，自動活化形成活性胱天蛋白酶,。在procaspase-1的情況下，活性胱天蛋白酶在自動切割后形成p10 / p20四聚體,。除了caspase-1,，NLRP1還可以聚集caspase-5到復合物中，但是caspase-5的作用仍在爭議當中,。與NLRP1,、NLRP3和AIM2相反，IPAF不會聚集銜接分子,，而是直接通過其CARD結(jié)構(gòu)域與procaspase-1相互作用（見下圖）,。但是，根據(jù)IPAF刺激,，IPAF下游的 caspase-1高程度的活化可能需要ASC或NAIP ,。不同炎癥小體的組裝引發(fā)了共同的下游級聯(lián)反應(yīng)，即炎性胱天蛋白酶的活化,。這些活化的炎性胱天蛋白酶包括人類caspase-1,、-4、5,，小鼠caspase-1,、-11、-12,。但是，caspase-1似乎是與炎癥小體相關(guān)的主要的炎性胱天蛋白酶,。炎性胱天蛋白酶均具有CARD結(jié)構(gòu)域,，隨后是含催化半胱氨酸殘基結(jié)構(gòu)域，而且之所以被稱之為炎性胱天蛋白酶,，是因為他們的主要底物是被切割成活躍可分泌形式的細胞因子（例如pro-IL-1β,、pro-IL-18和pro-IL-33）。此外,，活化的炎癥小體會導致某些細胞類型的宿主細胞死亡,，例如細胞凋亡,。細胞凋亡在限制侵入性病原體在細胞內(nèi)的復制中尤為重要。
圖1. 危險信號或細菌化合物可作為炎癥小體和NODs的激動劑,。
◆炎癥小體——活性調(diào)節(jié)
盡管調(diào)節(jié)炎癥小體活性的機制仍然難以捉摸,，但是已經(jīng)鑒定出各種可能干擾炎癥小體活化和依賴炎癥小體的胱天蛋白酶加工的蛋白。通常,，可以分為兩種炎癥小體調(diào)節(jié)亞型,，即含有CARD結(jié)構(gòu)域的亞型和具有PYD結(jié)構(gòu)域的亞型。此類蛋白質(zhì)不僅包含宿主衍生的炎癥小體調(diào)節(jié)劑,，而且還包含多種抑制caspase-1活化和病毒性PYD蛋白質(zhì)的細菌毒力因子,。
◆炎癥小體——治療意義
由于IL-1β與其他細胞因子是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，因此不難推測出IL-1β,、炎性胱天蛋白酶和炎癥小體在幾種疾病中發(fā)揮著重要的作用（見下圖）,。實際上，某些人類遺傳性疾病或獲得性疾病與IL-1β升高有關(guān),，其中一些疾病可以使用IL-1β或其受體的拮抗劑進行治療,。很多疾病，如冷卟啉相關(guān)周期性發(fā)熱綜合征（CAPS）,，與NLRP3突變有著直接的關(guān)聯(lián),。此外，痛風作為一種以關(guān)節(jié)嚴重發(fā)炎為病征的自發(fā)性疾病,，則與MSU晶體在關(guān)節(jié)中的沉積有關(guān),。由于MSU是一種有效的NLRP3炎癥小體激動劑，因此可以相信由炎癥小體調(diào)節(jié)的IL-1β導致了痛風發(fā)作,。此外,，NLRP3炎性小體分泌的IL-1β是由B細胞中較高的細胞外葡萄糖觸發(fā)的。,。IL-1β升高是導致二型糖尿?。═2DM）發(fā)病的危險因素，同時有助于胰島素抵抗,。因此,，作為代謝應(yīng)激傳感器的NlRP3炎癥小體，很可能以尿酸單鈉（MSU）或高血糖的形式,，分別作用于痛風或T2DM的發(fā)病,。另外，一些炎癥小體調(diào)節(jié)劑在疾病中具有重要意義,。經(jīng)證明,，患有FMF（家族性地中海熱）的患者體內(nèi)的吡啶是突變的。自身炎性疾病PAPA（化膿性關(guān)節(jié)炎，壞疽性膿皮病和痤瘡）中IL-1β水平升高與一種與吡啶相互作用蛋白——PSTPIP1突變有關(guān),?？偠灾@表明吡啶和炎癥小體調(diào)節(jié)劑在自身炎性疾病中的重要性,，并可能為疾病治療提供新的切入點,。
圖2. 炎癥小體相關(guān)疾病總覽
◆炎癥小體及其信號傳導的詳細內(nèi)容
NLRP1炎癥小體
近研究顯示抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL可以結(jié)合并抑制NLRP1。Bcl-2和Bcl-XL抑制ATP與NLRP1的結(jié)合,，這是寡聚化所必需的,。此外Bal-XL已顯示出抑制NLRP1寡聚化的作用。因此,，炎性胱天蛋白酶不能緊密貼近,，這對caspase-1自身活化和促炎性細胞因子的后續(xù)加工產(chǎn)生了負面影響。除了那些潛在性NLRP1活性調(diào)節(jié)劑外,，K+外流似乎對于NLRP1活化至關(guān)重要,。
NLRP3/NALP3炎癥小體
盡管NLRP3/NALP3炎癥小體確切的活化機制仍然在爭論中，但是研究者更偏向于以下三種模型：
1）NLRP3炎癥小體激動劑的細胞外ATP與其受體P2X7結(jié)合,，觸發(fā)K+外流和pannexin-1膜孔形成,。后者可以使細胞外因子進入細胞內(nèi)，成為NLRP3的直接激動劑,。NLRP3還可以感應(yīng)K+外流或細胞膜完整性,。
2）吞噬作用的結(jié)晶或顆粒狀的NLRP3配體（如MSU、明礬,、二氧化硅和石棉）后,，由于機械性損傷引起溶酶體失穩(wěn)和破裂，從而導致溶酶體內(nèi)容物釋放至細胞質(zhì)中,。由于該途徑對組織蛋白酶B抑制劑CA-074-Me敏感,，表明組織蛋白酶B（一種溶酶體蛋白酶）直接參與激活NLRP3配體。然而,，在組織蛋白酶B缺陷的巨噬細胞中,，并未發(fā)現(xiàn)響應(yīng)NLRP3配體（如MSU或明礬）改變IL-1β分泌或caspase-1裂解。關(guān)于NLRP3如何感應(yīng)細胞質(zhì)溶酶體含量仍是未解之謎,。
3）第三種模型涉及到了活性氧（ROS）的產(chǎn)生,。所有測試的NLRP3激動劑都會導致ROS的產(chǎn)生，此外ROS清除劑會抑制NLRP3的活化,。ROS的細胞來源目前仍未知,，盡管ROS對于NLRP3炎癥小體的活化似乎是必需的，但是還 不足夠,。在B細胞中，已發(fā)現(xiàn)ROS敏感性NLRP3配體TXNIP（硫氧還蛋白互作蛋白；VDUP1）參與觸發(fā)NLRP3活化,。
與NLRP1一樣,，細胞質(zhì)K+濃度似乎是NLRP3活化中的另一個重要參數(shù)。巨噬細胞在高鉀濃度下培養(yǎng)表明,，NLRP3依賴性caspase-1活化的降低可能意味著,，NLRP3活化的上游需要K+外排。
IPAF炎癥小體
IPAF炎癥小體被功能性的T3SS或T4SS革蘭陰性菌活化,，如鼠傷寒沙門氏菌,、福氏志賀氏菌、嗜肺軍團菌和綠膿桿菌,。初的研究顯示細胞質(zhì)鞭毛蛋白會觸發(fā)IPAF炎癥小體活性,。但是，無鞭毛細菌如福氏志賀氏菌,，也會誘導IPAF炎癥小體活化,，因此很可能存在其他IPAF激動劑。在NLRP3的情況下,，則顯示IPAF與SGT1和HSP90結(jié)合,。格爾德霉素對HSP90的抑制作用會阻斷IPAF活性，表明HSP90在某種程度上對于IPAF信號傳導極為重要,。不同于NLRP1和NLRP3,，IPAF活化不受細胞外的高濃度K+抑制，這表明IPAF不是離子通量的傳感器,。然而,，迄今仍未觀察到直接的配體受體相互作用。
AIM2炎癥小體
HIN-200家族成員AIM2充當細胞質(zhì)細菌,、病毒和宿主dsDNA的傳感器,，并通過形成AIM2炎癥小體觸發(fā)炎癥反應(yīng)。AIM2直接通過其C端HIN-200結(jié)構(gòu)域與dsDNA結(jié)合,。由于AIM2還識別宿主dsDNA,，因此它可能與自身免疫性疾病有關(guān)。AIM2炎癥小體的發(fā)現(xiàn)會如此引人注目不僅僅是因為AIM2是形成炎癥小體的第,一個非NLR家族成員,，還因為AIM2是直接與其配體相互作用的第,一個炎癥小體受體,。
圖3. 炎癥小體信號
◆炎癥小體檢測
炎癥小體是涉及生理和病理學炎癥的多蛋白復合物。caspase-1的免疫印跡是檢測炎癥小體活化的金標準,，但同時也存在一定的技術(shù)難題,，特別是在蛋白質(zhì)沉淀、蛋白質(zhì)分離與轉(zhuǎn)移方案的選擇方面,。致敏和激活步驟對于成功的免疫印跡來說也至關(guān)重要,。下表是用于炎癥小體檢測的Adipogen公司標準抗體的一系列方法和規(guī)程：
AG-20B-0042 | anti-Caspase-1 (p20) (mouse), mAb (Casper-1) | 檢測炎癥小體 | Download Protocol |
活性Caspase-1的免疫印跡 | Download Protocol | ||
原發(fā)性鼠骨中的炎癥小體激活和抑制 | Download Protocol | ||
骨髓衍生細胞以及IL-1α，IL-1β和Caspase-1的測定 | |||
評估Caspase-1活化 | Download Protocol | ||
AG-20B-0044 | anti-Caspase-1 (p10) (mouse), mAb (Casper-2) | 檢測炎癥小體 | Download Protocol |
AG-20B-0048 | anti-Caspase-1 (p20) (human), mAb (Bally-1) | 檢測炎癥小體 | Download Protocol |
AG-20B-0014 | anti-NLRP3/NALP3, mAb (Cryo-2) | 炎性小體激活的無細胞檢測 | Download Protocol |
檢測NLR齊聚反應(yīng)I：尺寸排阻色譜 | Download Protocol | ||
免疫共沉淀和交聯(lián) | |||
HEK293細胞中NLR的功能重建 | Download Protocol | ||
AG-25B-0006 | anti-Asc, pAb (AL177) | 檢測響應(yīng)細菌感染的炎癥小體活化 | Download Protocol |
檢測NLR齊聚II：檢測ASC斑點形成 | Download Protocol | ||
通過共聚焦顯微鏡和免疫熒光 | |||
炎性小體活化的無細胞檢測 | Download Protocol | ||
AG-20B-0010 | anti-ZBP1, mAb (Zippy-1) | ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways: T. Kuriakose, et al.; Sci. Immunol. 1, aag2045 (2016) | Publication |
◆關(guān)鍵的炎癥小體激動劑和抑制劑——包括新型Gasdermin抑制劑
產(chǎn)品列表
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 | 產(chǎn)品描述 |
AG-CR1-3950-M002 | Monosodium urate (crystals) | 2 mg | 強力NLRP3炎癥小體激動劑。 |
AG-CR1-3950-2002 | 2 mg×2 | ||
AG-CR1-3951-M010 | Monosodium urate [MSU] (ready-to-use) | 10 mg | |
AG-CN2-0020-M005 | Nigericin . sodium salt | 5 mg | 強力NLRP3炎癥小體激動劑,。 |
AG-CN2-0020-M025 | 25 mg | ||
AG-CN2-0489-M250 | N-Acetyl-D-glucosamine | 250 mg | 通過從線粒體解離己糖激酶來充當NLRP3炎癥小體的激動劑。 |
AG-CN2-0489-G001 | 1 g | ||
AG-CN2-0489-G005 | 5 g | ||
AG-CR1-3705-M005 | Necrosulfonamide NEW,！ | 5 mg | 直接與Gasdermin D結(jié)合以抑制N末端的寡聚化,， |
AG-CR1-3705-M025 | 25 mg | ||
AG-CR1-3698-M001 | U-73122 NEW,！ | 1 mg | Gasdermin D N末端片段（GSDMD-N）誘導的凋亡抑制劑,。 |
AG-CR1-3698-M005 | 5 mg | ||
AG-CR1-3615-M001 | MCC950 . Na | 1 mg | 強力的靶向性NLRP3炎癥小體抑制劑,。 |
AG-CR1-3615-M005 | 5 mg | ||
AG-CR1-3615-M010 | 10 mg | ||
AG-CN2-0459-M010 | Isoliquiritigenin | 10 mg | 抑制NLRP3活化的Asc寡聚化,。 |
AG-CN2-0459-M050 | 50 mg | ||
AG-CR1-0013-M010 | BAY 11-7082 | 10 mg | 降低NLRP3炎癥小體的ATPase活性,。 |
AG-CR1-0013-M050 | 50 mg | ||
AG-CR1-3616-M025 | (R)-3-Hydroxybutyric acid | 25 mg | 防止K+外流,，從而減少Asc寡聚化和顆粒形成。 |
AG-CR1-3616-M100 | 100 mg | ||
AG-CR1-3617-M025 | (S)-3-Hydroxybutyric acid | 25 mg | |
AG-CR1-3617-M100 | 100 mg | ||
CDX-H0080-G001 | DL-3-Hydroxybutyric acid sodium salt | 1 g | |
CDX-H0080-G010 | 10 g | ||
AG-CR1-0158-M001 | K777 [K11777] NEW,！ 半胱氨酸蛋白酶抑制劑 | 1 mg | 可用于抑制炎癥小體的廣域組織蛋白酶抑制劑,。 |
AG-CR1-0158-M005 | 5 mg |
◆NLRP3炎癥小體的預激活
NLRP3炎癥小體的突出功能是促白細胞介素-1β前體（pro-IL-1β）的加工和活化。然而,，大多數(shù)細胞不表達pro-IL-1β,，因此需要先激活pro-IL-1β的表達。這可以通過刺激受體如TLRs（如通過LPS）,、Nods,、tNF-Rs（如通過TNF-α）或IL-1R1（通過IL-1α和IL-1β）激活NF-κB并啟動pro-IL-1β轉(zhuǎn)錄。這種pro-IL-1β誘導過程稱為致敏（priming）（第1個信號）,。Priming還誘導NlRP3的NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄,。
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產(chǎn)品列表
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
AG-CU1-0001-M001 | Kdo2-Lipid A (ready-to-use) (THE STANDARD) | 1 mg |
IAX-100-009-C500 | LPS (Universal) from S. abortus equi (S-form) TLRpure™ Sterile Solution (THE STANDARD) 脂多糖（通用）來源于馬流產(chǎn)沙門氏菌（S-form） TLRpure™ 無菌溶液
| 500 μg |
IAX-100-009-M001 | 1 mg | |
IAX-100-009-5001 | 1 mg×5 | |
IAX-100-007-C500 | LPS from E. coli R515 (Re) TLRpure™ Sterile Solution (THE STANDARD) 脂多糖來源于大腸桿菌 R515（Re）TLRpure™ 無菌溶液
| 500 μg |
IAX-100-007-M001 | 1 mg | |
IAX-100-007-5001 | 1 mg×5 | |
IAX-100-006-C500 | LPS from E. coli O8:K27 (S-form) TLRpure™ Sterile Solution | 500 μg |
IAX-100-006-M001 | 1 mg | |
IAX-100-006-5001 | 1 mg×5 | |
IAX-100-015-C500 | LPS from S. minnesota R345 (Rb) TLRpure™ Sterile Solution | 500 μg |
IAX-100-015-M001 | 1 mg | |
IAX-100-015-5001 | 1 mg×5 | |
IAX-100-008-C500 | LPS from S. minnesota R595 (Re) TLRpure™ Sterile Solution | 500 μg |
IAX-100-008-M001 | 1 mg | |
IAX-100-008-5001 | 1 mg×5 |
查看我們的炎癥小體預激活TNF-α蛋白
產(chǎn)品列表
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
AG-40B-0006-C010 | TNF-alpha, Soluble (human) (rec.) | 10 μg |
AG-40B-0006-C050 | 50 μg | |
AG-40B-0006-3050 | 50 μg×3 | |
AG-40B-0019-3010 | TNF-alpha (human) (multimeric) (rec.) | 10 μg×3 |
AG-40B-0019-C010 | 10 μg | |
AG-40B-0021-C010 | TNF-alpha (mouse) (multimeric) (rec.) | 10 μg |
AG-40B-0021-3010 | 10 μg×3 |