洋蔥伯克氏菌熒光定量PCR試劑盒(探針法)

Burkholderia cepacia qPCR Kit(Probe Method)

產(chǎn)品簡介：

熒光定量 PCR 是檢測(cè)傳染性疾病的主流技術(shù),，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)洋蔥伯克氏菌的試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 即開即用,，用戶只需要提供病毒 DNA 模板,。

2. 引物經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高,。

3. 提供陽性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)洋蔥伯克氏菌高度保守的 VP1 區(qū)設(shè)計(jì),。

5. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳,。

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洋蔥伯克氏菌熒光定量PCR試劑盒(探針法)包裝規(guī)格及成分：

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，有效期一年,。

自備試劑：DNA 模板

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使用方法：

一.稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對(duì)照,。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）,。

3.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

4.換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

5.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

二.樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品,，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,?？梢杂?10μL 上步制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）或第 5 號(hào)（濃度為 1×10E5 拷貝/μL,，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC。另外用水作為NC,。如果每次制備需要 200μL 樣品,，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL,。

8.用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。?

三,、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。如果做 2-3次重復(fù),，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍,。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照,，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）,。

四,、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理
12.以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度,。

六、電泳檢測(cè) 
13.如果有必要電泳確認(rèn),，可取 10-20 uL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn) 物的大小為 400 bp,。

熒光定量PCR結(jié)果分析:
一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段,、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期,。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,，無法判斷產(chǎn)物量的變化;在平臺(tái)期,，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,，無法計(jì)算起始模板拷貝數(shù),。因此只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,，故選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析,。為了定量方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了幾個(gè)重要的概念：擴(kuò)增曲線,、熒光閾值,、CT值。