木霉屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Trichoderma spp.

產(chǎn)品及特點(diǎn)

木霉屬（Trichoderma spp.）真菌廣泛分布于自然界,，在腐木、種籽,、植物殘體,、 有機(jī)肥、土壤和空氣中尤多,，也可寄生并危害多孔菌和傘菌等大型真菌,。主要種類有 綠色木霉和康氏木霉等。是纖維素酶的重要生產(chǎn)菌,，也是木材和有關(guān)工業(yè)產(chǎn)品的破壞 者,。木霉能生產(chǎn)纖維素酶，合成核黃素,，生產(chǎn)抗生素,，轉(zhuǎn)化甾族化合物。木霉也常寄 生于某些真菌的子實(shí)體上,，因此是栽培蘑菇的勁敵,。本公司開發(fā)木霉屬通用染料法熒 光定量 PCR 試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板,。

2. 引物根據(jù)木霉屬通用專一區(qū)設(shè)計(jì),，特異性高。

3. 熒光定量 PCR 檢測,，比常規(guī) PCR 更加靈敏,。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染,。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR,。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷,。  

木霉屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為 12 個月,。

自備試劑   樣品 DNA,。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽性對照濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千 萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病 原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽 性對照。

2. 標(biāo)記 6 個離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用,。

5. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用,。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,，充分 震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用,。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品,，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）,， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋 的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL,，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原 液加入到 990μL 自備 TE 溶液中,，充分混勻,，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此 稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中,，充分混勻,，此為 10000 倍稀釋液）再加 上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取 決于所用試劑盒的要求）,?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡Ｖ苽渌贸蔀闃悠?DNA,。

9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼 容。

三,、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上 步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性 分析,，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（用 第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）,。下面只描述定量分析的步驟,， 定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變,。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢 后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。

四,、數(shù)據(jù)處理

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱 軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等 于 36,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30,。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 36 則為陰性，如果小于或等于 35 則為 陽性,。如果在 35-36 之間,，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 36,，擴(kuò)增曲線有 明顯起峰,，該樣本判斷為陽性，否則為陰性,。