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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0689	應用領域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率,、更高的擴增靈敏度,、更高的擴增特異性。

無乳鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒

Streptococcus agalactiae

產(chǎn)品及特點

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是一種革蘭氏陽性鏈球菌，因先從患乳腺炎的牛中分離而得名,。隨后在各國孕產(chǎn)婦和新生兒中分離到,，可引起新生兒早發(fā)和晚發(fā)型感染,，無乳鏈球菌也被發(fā)現(xiàn)于各種畜牧及水產(chǎn)魚類的流行病中，因此受到廣泛關注,。該菌能導致動物體產(chǎn)生敗血癥和腦膜炎,，且具有較高的致死率。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測無乳鏈球菌的試劑盒,，它具有下列特點：

1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高,。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)無乳鏈球菌高度保守區(qū)設計，不會跟其他病原 DNA 發(fā)生交叉反應,。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應,。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

無乳鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色蓋）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	無乳鏈球菌探針法 qPCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	無乳鏈球菌 qPCR 探針	50 μL（棕色管）
試劑五	無乳鏈球菌探針法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL)	50 μL（黃蓋）
試劑六	使用手冊	1 份

運輸及保存 低溫運輸,、-20℃保存,，有效期一年。

自備試劑 DNA 模板,、10×ROX（根據(jù)機型決定,，具體見使用方法）。

使用方法 一,、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品,，好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）,，一個是 NC（樣品制備陰性對照）,。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC。另外用水作為 NC,。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三,、Probe qPCR 反應（20μL 體系,，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線,。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分	樣品管 N+2個	PCR陰性對照管	標準曲線樣品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
無乳鏈球菌qPCR探針	1 μL	1 μL	各1 μL
無乳鏈球菌探針法qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2個待測DNA模板	7 μL	不加	不加
超純水	不加	7 μL	不加
第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號）	不加	不加	各7 μL（2號樣到2號管,，3號樣到3號管…）

11.蓋上蓋子后上機,，按下面參數(shù)進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	3 min
PCR反應（40個循環(huán)）	95℃	15sec
PCR反應（40個循環(huán)）	60℃	1 min（采集 FAM 通道的熒光信號）

四、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線,，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,，則重復一次,。若重復結果 Ct 值小于 40，擴增曲線有明顯起峰,，該樣本判斷為陽性,，否則為陰性。