塞內加谷病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Seneca Valley virus(SVV)

產品及特點

塞內加谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)是一種RNA病毒,，豬感染塞內加谷病毒引起的病變與口蹄疫感染類似,，但該病對豬并沒有致命性，對人的健康也無影響,。已在巴西,、美國等國發(fā)生，仔豬感染可導致死亡,，因此快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用,。本產品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點：

1.一站式,，用于不需要單獨準備每種成分,，包括引物和對照。
2.根據塞內加谷病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性,。
3.基于染料法qRT-PCR檢測,，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應,。
4.使用一管式qRT-PCR技術,，RT和PCR兩步在一個試管內完成，不需要中間轉移樣品,，降低了操作誤差和可能的污染,。
5.本產品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研,，不能用于臨床,。

塞內加谷病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸,、-20℃保存(陽性對照分開放置),，有效期一年。 

自備試劑   樣品 DNA,。

使用方法 一,、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行）,。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。
1.標記6個離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3，2,。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液,，用帶芯槍頭，下同）,。
2.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
3.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
4.換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用,。
二,、樣品RNA的制備
5.如果有N個樣品，必須設置N+2個提取,，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照）,，一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL,，10μL相當于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）,?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡?br />6.用自選方法純化N+2個樣品的RNA,，本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容,。
三、設置RT-PCR反應（20μL體系,，在樣品制備室進行）
7.如果做定量分析并且只做1次重復,，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照,，6個用于標準曲線。如果做定性分析,，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）,。下面只描述定量分析的步驟,，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變,。
8.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

9.上機后按下面參數進行RT-PCR（參數可能會因儀器不同而需優(yōu)化）,。

四,、數據處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線,，Ct值應該小于或等于30,。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間，則重復一次,。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40，則為陽性,。