狂犬病病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Rabies Virus

產(chǎn)品及特點(diǎn)

狂犬病病毒（Rabies Virus, RV）屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬,，為 RNA 病毒，它 是引起狂犬病的病原體,?？袢《緯?huì)引發(fā)狂犬病，屬于人畜共患的傳染病,，由于該病毒 能對(duì)人體健康造成嚴(yán)重?fù)p害,，因此快速檢測(cè)狂犬病病毒具有重要意義。本試劑盒根據(jù) RT-PCR 原理開(kāi)發(fā),，具有下列特點(diǎn)：

1. 使用本公司開(kāi)發(fā)的一管式熒光定量 RT-PCR試劑盒,，靈敏度比常規(guī) RT-PCR高2-3 個(gè)數(shù)量級(jí)，可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng),。

2. 封閉式,，避免擴(kuò)張產(chǎn)物對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的污染,。

3. 根據(jù)狂犬病病毒的保守序列設(shè)計(jì)的專一性 RT-PCR 引物，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng),。

4. 即開(kāi)即用,，用戶只需要提供樣品模板，操作簡(jiǎn)單,，定量準(zhǔn)確快速,。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 RT-PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷,。 

狂犬病病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存(陽(yáng)性對(duì)照分開(kāi)放置),，有效期一年,。 

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一,、 稀釋陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。

1. 注意：本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的核酸片段作為陽(yáng) 性對(duì)照,。下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的 其他成分。

2. 標(biāo)記 6 個(gè) RNase-free 離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。

3. 用帶芯 RNase-free 槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,。

4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。

6. 換槍頭,，從 6 號(hào)管中取 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震 蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。

二、樣品 RNA 的制備 8. 如果有 N 個(gè)樣品,，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）， 一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,?？梢杂?10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照梯度稀釋液 中的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 copy/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝）或第 5 號(hào)（濃 度為 1×10E5 copy/μL,，10μL 相當(dāng)于 10 萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水作為制備 的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要 求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照,。

9. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試 劑盒兼容,。

三,、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè) 樣品，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照,，6 個(gè)用于 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照）,。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加,。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢 后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）： 

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（具體 RT-PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不 同而自行優(yōu)化）,。 

13. 如果 PCR 陽(yáng)性對(duì)照和 PCR 陰性對(duì)照均得到預(yù)期陽(yáng)性和陰性結(jié)果,，則說(shuō)明 PCR 有 效，可以進(jìn)行后續(xù)分析,。以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸,，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,， 再推算出其濃度,。

14. 如果 PCR 陽(yáng)性對(duì)照或 PCR 陰性對(duì)照任何一個(gè)沒(méi)有得到預(yù)期陽(yáng)性和陰性結(jié)果（如 PCR 陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增，或陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增）,，則說(shuō)明 PCR 實(shí)驗(yàn)無(wú)效或污染,， 不需要進(jìn)行后續(xù)分析，需要重復(fù) PCR 或請(qǐng)跟廠家聯(lián)系,。

15. 如果樣品制備陽(yáng)性對(duì)照或樣品制備陰性對(duì)照均得到預(yù)期陽(yáng)性和陰性結(jié)果,，說(shuō)明樣品 制備操作有效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效,。

16. 如果樣品制備陽(yáng)性對(duì)照或樣品制備陰性對(duì)照任何一個(gè)沒(méi)有得到預(yù)期結(jié)果（如樣品制 備陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增,，或樣品制備陰性對(duì)照有擴(kuò)增），說(shuō)明樣品制備操作無(wú)效或有污 染,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效,，需要重復(fù)樣品制備過(guò)程或請(qǐng)跟廠家聯(lián)系。