偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Pseudorabies Virus(PrV)

產(chǎn)品及特點

偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,，PrV) 會引起偽狂犬病，病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異：哺乳仔豬為敏感,，15日齡以內(nèi)的仔豬常表現(xiàn)為急性型,，主要表現(xiàn)為體溫升高、拉稀,、發(fā)抖,、運動不協(xié)調(diào)、流涎,、頸部肌肉僵硬,、四肢劃水樣運動，后昏迷死亡,；育肥豬則大多數(shù)伴有體溫升高,，呼吸困難，一般不發(fā)生死亡,，耐過后呈長朗隱性感染帶毒或排毒,；成年豬常不呈現(xiàn)可見臨床癥狀或僅表現(xiàn)為輕微體溫升高，一般不發(fā)生死亡,。母豬妊娠初期,，可在感染后的20天左右發(fā)生流產(chǎn)，在妊娠后期,，經(jīng)常發(fā)生死胎和木乃伊,，或者產(chǎn)出弱胎和死胎。在完成豬瘟凈化的地區(qū),，偽狂犬病被認(rèn)為是對經(jīng)濟影響大的豬病毒病,，因此偽狂犬病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用,，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用,，用戶只需要提供病毒樣品,。
2.根據(jù)偽狂犬病病毒保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng),。
3.靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。
4.一管式熒光定量PCR檢測,，避免后續(xù)污染,。
5.本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
6.本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷,。

偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存,，保存期限為 12 個月,。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 

一,、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽性對照濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千 萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病 原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽 性對照,。

2. 標(biāo)記 6 個離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）,。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),， 充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用。

6. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用,。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取,，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）,， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋 的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL,，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原 液加入到 990μL 自備 TE 溶液中,，充分混勻,，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此 稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中,，充分混勻,，此為 10000 倍稀釋液）再加 上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取 決于所用試劑盒的要求）,?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡Ｖ苽渌贸蔀闃悠?DNA,。

9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼 容。

三,、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系,，在樣品制備室進行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上 步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性 分析,，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（用 第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）,。下面只描述定量分析的步驟,， 定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變,。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢 后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

12.蓋上蓋子后上機,，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

13.數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行,。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時，大吸收光譜在471 nm,，結(jié)合DNA時的大吸收光譜在500 nm,，大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟,。
四,、數(shù)據(jù)處理
14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。
15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40，則為陽性,。