豬圓環(huán)病毒通用探針法熒光定量PCR試劑盒

Porcine Circovirus 3 (PCV-3)

產品及特點

豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus，PCV）有 PCV-1 和 PCV-2 兩種型,， 其基因組為單鏈 DNA,，長度分別為 1759nt 和 1768nt,，其同源性低于 80%， 但基因組結構相似,。PCV-1 無致病性,，廣泛存在于豬體內。PCV-2 對豬具有較 強的易感性,，感染豬可自鼻液,、糞便等廢物中排出病毒，經口腔,、呼吸道途徑感 染不同年齡的豬,。感染病毒后的病豬常見的癥狀是豬只漸進性消瘦或生長遲 緩，這也是診斷所必需的臨床依據,，其他癥狀有厭食,、精神沉郁、行動遲緩,、皮 膚蒼白,、被毛蓬亂、呼吸困難,，咳嗽為特征的呼吸障礙,，較少發(fā)現(xiàn)的癥狀為腹瀉 和中樞神經系統(tǒng)紊亂，一旦感染該病毒,，發(fā)病率一般很低而病死率都很高,，對養(yǎng) 豬業(yè)帶來較大的經濟損失。本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發(fā),， 專門檢測豬圓環(huán)病毒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2. 引物和探針經過優(yōu)化，靈敏性高,。

3. 提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,，引物是根據豬圓環(huán)病毒通用高度保守區(qū)設計,，不會跟其他病毒 DNA 發(fā)生交叉反應。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應,。

6. 本產品只能用于科研,。 

豬圓環(huán)病毒通用探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存,，保存期限為 12 個月,。

自備試劑  樣品 DNA,。

使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。 由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標記 6 個離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭,， 下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品,，好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照）,，一個是 NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC,。另外用水作為 NC,。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容,。

三,、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,，則標記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標準曲線,。如果做定性分析，并且只做 1 次重復,，則標記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用 水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。 10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后后加）：

11.蓋上蓋子后上機,，按下面參數(shù)進行PCR：

四,、數(shù)據處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值 為縱軸,，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線,，Ct 值應該 小于或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小 于或等于 35 則為陽性,。如果在 35-40 之間，則重復一次,。若重復結果 Ct 值小于 40,，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,，否則為陰性,。