馬蘇大麻哈魚病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Oncorhynchus Masou Virus(OMV)

產(chǎn)品及特點

馬蘇大麻哈魚病毒(Oncorhynchus Masou Virus，OMV)會引起馬蘇大麻哈魚病毒病,，是一種腫瘤病和皮膚潰瘍病,，僅感染鮭科魚類，并流行于日本,，在水溫低于14℃時易發(fā)此病,。感染初期出現(xiàn)全身性、高度致死性感染,，表現(xiàn)為厭食,、眼突出、表皮充血和皮膚潰瘍等癥狀,。解剖時可見肝,、脾壞死及心肌水腫，腸道出血以及肝上有白斑,，并伴有水腫和出血,。后期即從出現(xiàn)臨床癥狀后的4個月里，部分存活下來的病魚會出現(xiàn)上皮瘤,。瘤主要長在口腔周圍（上,、下腭），有些長在尾鰭,、鰓蓋骨和體表,，腫瘤增生可持續(xù)到感染后一年。該病毒的感染會給水產(chǎn)業(yè)帶來較的經(jīng)濟(jì)損失,，因此馬蘇大麻哈魚病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用,，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的馬蘇大麻哈魚病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用,，用戶只需要提供病毒樣品,。
2.根據(jù)馬蘇大麻哈魚病毒保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng),。
3.靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng),。
4.一管式熒光定量PCR檢測,，避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR,。
6.本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷。

馬蘇大麻哈魚病毒染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存,，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA,。

使用方法 

一,、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽性對照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行,，千 萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病 原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽 性對照,。

2. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）,。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用,。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,，充分 震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用,。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用,。

二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品,，必須設(shè)置 N+2 個提取,，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋 的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL,，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝,，可以將 10μL 原 液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻,，此為 100 倍稀釋液,。再取 10μL 此 稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻,，此為 10000 倍稀釋液）再加 上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品體積多少取 決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。制備所得成為樣品 DNA。

9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼 容,。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上 步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照,，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性 分析,，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（用 第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）,。下面只描述定量分析的步驟,， 定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變,。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢 后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

12.蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）,。

四、數(shù)據(jù)處理

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大于或等 于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于或等于 35 則為 陽性。如果在 35-40 之間,，則重復(fù)一次,。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴(kuò)增曲線有 明顯起峰,，該樣本判斷為陽性,，否則為陰性。