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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0538	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率,、更高的擴增靈敏度,、更高的擴增特異性,。

新型布尼亞病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Novel Bunyavirus

產(chǎn)品及特點

新型布尼亞病毒,，衛(wèi)生部門從蜱蟲中毒者體內(nèi)分離出的病毒,。或?qū)⒈徽J定為一種新型病毒,。從目前來看,，這一病毒主要由蜱傳播，且可以治療,，病死率很低,。目前未發(fā)現(xiàn)人傳染人的病例。布尼亞病毒自然感染見于許多脊椎動物和節(jié)肢動物(蚊,、蜱,、白蛉等)，可感染小鼠,，并能在一些哺乳類,、鳥類和蚊細胞培養(yǎng)中生長;對人可引起類似流感或登革熱的疾病、出血熱(立夫特谷熱和克里米亞─剛果出血熱等)及腦炎(加利福尼亞腦炎),。有蚊媒,、蜱媒、白蛉媒 3 種傳播類型,。本產(chǎn)品是基于染料法熒光定量 PCR 原理開發(fā),，專門檢測新型布尼亞病毒的試劑盒。它具有下列特點：

1.一站式,，用于不需要單獨準備每種成分,，包括引物和對照。
2.根據(jù)新型布尼亞病毒的保守基因序列設(shè)計的引物,，具有良好的特異性,。
3.基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應(yīng),。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù),，RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,，降低了操作誤差和可能的污染,。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研,，不能用于臨床,。

新型布尼亞病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成份	規(guī)格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL（棕色管）
試劑二	10×qRT-PCR酶混合液	100 μL（紅蓋）
試劑三	ROX染料I	50 μL（棕色管）
試劑四	ROX染料II	50 μL（棕色管）
試劑五	熒光PCR模板稀釋液	1mL（亮黃蓋）
試劑六	新型布尼亞病毒RT-PCR引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑七	新型布尼亞病毒RT-PCR陽性對照（1×10E8拷貝/μL）	50 μL（黃蓋）
試劑八	天凈沙核酸釋放劑試用裝	20次（1mL，綠蓋）
試劑九	使用手冊	1份

運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置,。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供RNA段作為陽性對照,。

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一,、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。
1.標記6個離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3，2,。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液,，用帶芯槍頭，下同）,。
2.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
3.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
4.換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用,。
二,、樣品RNA的制備
5.如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取,，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照）,，一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL,，10μL相當于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）,?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡?br />6.用自選方法純化N+2個樣品的RNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容,。
三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進行）
7.如果做定量分析并且只做1次重復,，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照,，6個用于標準曲線。如果做定性分析,，并且只做1次重復,，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照（用水做模板）,，1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟,，定性分析只是把6個標曲反應(yīng)縮減成1個,，其余不變。
8.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

成分	N+2個制備所得樣品	RT-PCR陰性對照	RT-PCR陽性對照（2-7管）
2×qRT-PCR 緩沖液	10μL	10μL	各10μL
新型布尼亞病毒RT-PCR 引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (見注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
樣品制備所得RNA模板（來于第8步）	5.6μL	不加	不加
稀釋所得6個陽性對照（來于第6步）	不加	不加	各5.6μL（2號樣到2號管,，3號樣到3號管…）
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

9.上機后按下面參數(shù)進行RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。

過程	溫度	時間
RT（逆轉(zhuǎn)錄）	50℃	30 min
預變性	95℃	10 min
RT - PCR反應(yīng) （30個循環(huán)）	95℃	15 秒
RT - PCR反應(yīng) （30個循環(huán)）	60℃	1 min（采集 SYBR 通道的熒光信號）

四,、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸,，繪制標準曲線,。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度,。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間,，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽性。