支原體通用探針法熒光定量PCR試劑盒

Mycoplasma spp.

產(chǎn)品及特點

支原體和親緣關(guān)系很近的無膽甾原體,、螺旋體統(tǒng)稱霉形體。霉形體是目前發(fā) 現(xiàn)的小的,、簡單的原核生物,。它們?nèi)狈毎凇⒂凶冃文芰?、能通過濾菌器、 可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖,，成為細胞培養(yǎng)中常見的一種污染源,，嚴(yán)重影響細 胞生長率、細胞形態(tài),、基因表達,、細胞代謝和細胞活力。因此快速靈敏檢測支原 體具有重要意義,。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒,，它具有下 列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高,。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)支原體高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他微生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng),。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng),。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。 

支原體通用探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸,、-20℃保存，有效期一年,。

自備試劑  DNA 模板,、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）,。

使用方法 一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭， 下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，好設(shè)置 N+2 個提取,，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照）,，一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC。另外用水作為 NC,。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容。

三,、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用 水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。 10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后后加）：

11.蓋上蓋子后上機,，按下面參數(shù)進行PCR：

四,、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值 為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽性,。如果在 35-40 之間,，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40,，擴增曲線有明顯起峰,，該樣本判斷為陽性，否則為陰性,。