牛分枝桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Mycobacterium bovis

產(chǎn)品及特點(diǎn)

牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)是引起牛結(jié)核病的主要病原體，舊稱牛 型結(jié)核分枝桿菌,，對(duì)牛和其他家畜有致病性,。形態(tài)、染色和生長(zhǎng)特性與人型結(jié)核 分枝桿菌基本相似,。在抗原結(jié)構(gòu)上,，牛型菌株與人型菌株有共同抗原存在，因而 可用減毒的牛分枝桿菌(即卡介苗)接種預(yù)防人的結(jié)核病,。本菌能引起牛,、馬、豬 的進(jìn)行性和致死性結(jié)核病,。對(duì)綿羊和山羊也可引起進(jìn)行性結(jié)核病,，但不常見。人 對(duì)本菌也易感,，特別是兒童,，絕大多數(shù)病例受害部位為淋巴結(jié)和腹腔器官,， 肺 部受侵害的不常見,。因此牛分枝桿菌的檢測(cè)具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以染料 法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)牛分枝桿菌的試劑盒,，它具有下列 特點(diǎn)：

1.即開即用,，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高，引物是根據(jù)牛分枝桿菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他細(xì)菌,。

3. 引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無(wú)傳染性的 PCR 陽(yáng)性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品,。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測(cè),，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染,。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR,。

牛分枝桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存,，保存期限為 12 個(gè)月,。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一,、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無(wú)傳染性的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，好用帶芯槍頭,， 下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL,，試劑盒提 供),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

4. 換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

8. 如果有 N 個(gè)樣品,，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備 陽(yáng)性對(duì)照管,、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管,。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果進(jìn)行定量分析,，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定 性分析,，則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào),，其余樣品不變）。 以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置,。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）,。

四,、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的融解曲線分析,，排除假陽(yáng)性,。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度,。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 40,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小 于或等于 35 則為陽(yáng)性,。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,，如果小于 40，則為陽(yáng)性,。