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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0459	應用領域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度,、更高的擴增特異性。

單核細胞增生李斯特菌探針法定量PCR試劑盒

Listeria monocytogenes

產(chǎn)品及特點

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)屬乳酸桿菌科,，為革蘭氏陽性小桿菌，可以污染食品,，導致李斯特病的發(fā)病率日趨上升,，臨床表現(xiàn)主要有腦膜炎、敗血性肉芽腫,、淋巴結(jié)腫大等,。本病遍及世界各地，是人畜共患的傳染病,。人類感染有增多趨勢,，特別是新生兒、老年人,、孕婦及免疫功能低下者易感性更高,。對食品中的單增利斯特菌做出快速的檢測和鑒定，是預防利斯特病的有效方法,，因此單核細胞增生李斯特菌的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用,。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術為基礎開發(fā)的專門檢測單核細胞增生李斯特菌的試劑盒,，它具有下列特點：

1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高,。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高,，引物是根據(jù)人單核細胞增生李斯特菌高度保守的VP1區(qū)設計，不會跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應,。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研,。

單核細胞增生李斯特菌探針法定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qRT-PCR MagicMix	500 μL（本色蓋）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	單核細胞增生李斯特菌PCR引物	100 μL（白蓋）
試劑四	單核細胞增生李斯特菌qPCR探針	50 μL（棕色管）
試劑五	單核細胞增生李斯特菌陽性對照2.0 (1×10E8拷貝/μL)	50 μL （紅蓋）
試劑六	天凈沙核酸釋釋劑（試用裝）	50次（試用裝）
試劑七	使用手冊	1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存,，保存期限為 12 個月,。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法 一,、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品,，設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）,，一個是 NC（樣品制備陰性對照）,。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC,。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容,。

三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系,，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標準曲線。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復,，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分	樣品管 N+2個	PCR陰性對照管	標準曲線樣品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix（本色蓋）	10 μL	10 μL	各10 μL
單核細胞增生李斯特菌 qPCR探針（綠蓋）	2 μL	2 μL	各2 μL
伊氏李斯特菌 PCR引物混合液（白蓋）	2 μL	2 μL	各2 μL
待測樣品DNA模板	6 μL	不加	不加
第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號）	不加	不加	各6μL（2號樣到2號管,，3號樣到3號管…）

11. 蓋上蓋子后上機,，按下面參數(shù)進行 PCR：

過程	溫度	時間
預變性	94℃	5 min
PCR反應（40個循環(huán)）	94℃	0.5 min
	50℃	0.5 min（采集FAM通道的熒光信號）
	72℃	0.5 min
后延伸	72℃	10min

五、數(shù)據(jù)處理
12.以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。
六,、電泳檢測
13.如果有必要電泳確認，可取10-20μL PCR產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物的大小為400 bp,。但電泳非常容易污染實驗環(huán)境,，建議不輕易采納。