單核細(xì)胞增生李斯特菌染料法定量PCR試劑盒

Listeria monocytogenes

產(chǎn)品及特點(diǎn)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)屬乳酸桿菌科，為革蘭氏陽性小桿菌,，可以污染食品,，導(dǎo)致李斯特病的發(fā)病率日趨上升，臨床表現(xiàn)主要有腦膜炎,、敗血性肉芽腫,、淋巴結(jié)腫大等。本病遍及世界各地,，是人畜共患的傳染病,。人類感染有增多趨勢，特別是新生兒,、老年人,、孕婦及免疫功能低下者易感性更高。對食品中的單增利斯特菌做出快速的檢測和鑒定,，是預(yù)防利斯特病的有效方法,，因此單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術(shù),，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供DNA模板,。
2.特異性高,，引物是根據(jù)人單核細(xì)胞增生李斯特菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他細(xì)菌。

3.引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性比常規(guī)PCR高100倍,。
4.提供無傳染性的PCR陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品,。
5.一管式操作,，熒光PCR檢測，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染,。
6.本產(chǎn)品只能用于科研,，本試劑盒足夠50次20μL體系的PCR。

單核細(xì)胞增生李斯特菌染料法定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月,。

自備試劑   樣品 DNA,。

使用方法 一,、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭,， 下同）,。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提 供),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

4. 換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

8. 如果有 N 個(gè)樣品,，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備 陽性對照管,、另一個(gè)用作樣品制備陰性對照管,。

三,、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果進(jìn)行定量分析,，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。如果做定 性分析，則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào),，其余樣品不變）,。 以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

四,、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五,、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析，排除假陽性,。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 32,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 32 則為陰性，如果小 于或等于 30 則為陽性,。如果在 30-32 之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 32 則為陰性,，如果小于 30,，則為陽性。