乳酸桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Lactococcus spp.

產(chǎn)品及特點

乳酸桿菌是可使葡萄糖等糖類分解為乳酸的各種細菌的總稱,。乳酸菌是一種無芽孢 的桿菌，屬革蘭氏陽性菌，厭氧性呼吸,。廣泛分布于自然界,，有些菌株是人和動物口 腔、腸道及陰道的正常菌群之一,，很少致病,，除極偶爾引起亞急性細菌性心內(nèi)膜炎外， 對人基本無害,。寄生于口腔的乳酸桿菌在齲齒發(fā)生中起重要作用,。一般認為寄生于腸 道和陰道的乳酸桿菌對機體有保護作用某些乳桿菌如嗜酸性乳桿菌、保加利亞乳桿菌,， 常用于飲料的發(fā)酵工業(yè),。本公司開發(fā)乳酸桿菌屬通用染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它 具有下列特點：

1. 即開即用,，用戶只需要提供 DNA 模板,。

2. 引物根據(jù)乳酸桿菌屬專一區(qū)設(shè)計，特異性高,。

3. 熒光定量 PCR 檢測,，比常規(guī) PCR 更加靈敏,。

4. 一管式閉管操作,，降低了交叉污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR,。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷。

乳酸桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存，保存期限為 12 個月,。

自備試劑   樣品 DNA,。

使用方法 一、制備標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。 由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標記 6 個離心管,，分別為 7，6,，5,，4,，3，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭， 下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL,，試劑盒提 供)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有 N 個樣品,，則需要進行 N+2 個樣品提取,，多出的一個用作樣品制備 陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管,。

三,、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果進行定量分析,，則標記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照,，6 個用于標準曲線樣品,。如果做定 性分析，則 6 個標準曲線樣品只選一個做（可以選 4 號，其余樣品不變）,。 以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置,。

10. 在標記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機,，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）,。

四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五,、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析,，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 32。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線,，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 32 則為陰性,，如果小 于或等于 30 則為陽性。如果在 30-32 之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 32 則為陰性,，如果小于 30,，則為陽性。