JC病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

John Cunningham Virus(JCV )

產(chǎn)品及特點(diǎn)

JC 病毒（John Cunningham Virus,，JCV）屬于乳多空病毒科（Papovaviridae） 多瘤病毒屬（Orthopolyomavirus），1971 年從進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦?。?progressive multifocal leukoencephalopathy,，PML）患者的腦中分離并以該患者名字命名，普 通人群血清陽(yáng)性檢測(cè)率為 40%~60%,，因 AIDS 并發(fā) PML 的患者致死率約為 50%,， 對(duì)于免疫力缺陷和免疫力低下的既往感染者，還會(huì)引起多瘤病毒相關(guān)性腎病 （polyomavirus-associated nephropathy,，PVAN）,、病毒血癥等相關(guān)疾病，并與 胃癌,、肺癌,、食管癌等癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，但其致病機(jī)理尚未闡明,。由于目前無(wú)特異 的預(yù)防和治療方法,，因此在病毒感染早期的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)疾病的診斷和治療十分關(guān)鍵,，尤 其在免疫低下的人群中實(shí)現(xiàn)高效、及時(shí)的檢測(cè)至關(guān)重要,。為此本公司開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)單 快捷的 JC 病毒染料法熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)： 

1. 即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供病毒樣品,。

2. 根據(jù) JC 病毒保守序列設(shè)計(jì)的專(zhuān)一性引物,，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。

3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng),。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染,。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR,。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷,。 

JC病毒染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存,，保存期限為 12 個(gè)月,。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一,、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無(wú)傳染性的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭,， 下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL,，試劑盒提 供),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用,。

4. 換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品,。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

8. 如果有 N 個(gè)樣品,，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備 陽(yáng)性對(duì)照管,、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管,。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果進(jìn)行定量分析,，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。如果做定 性分析,，則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào),，其余樣品不變）。 以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置,。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）,。

四,、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五,、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的熔解曲線(xiàn)分析,，排除假陽(yáng)性,。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度,。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 32,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線(xiàn),，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 32 則為陰性,，如果小 于或等于 30 則為陽(yáng)性。如果在 30-32 之間,，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 32 則為陰性,，如果小于 30,，則為陽(yáng)性。