日本腦炎病毒探針?lè)晒舛縍T-PCR試劑盒

Japanese Encephalitis Virus(JEV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

日本腦炎又稱為流行性腦炎,。該病是日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)引起的影響中樞神經(jīng)的急性傳染病,。在亞洲與東南美洲日本腦炎流行十分 普遍。在美國(guó)的塞班島與澳洲大陸等地區(qū)也出現(xiàn)了日本腦炎的病例,。日本腦炎是 自然病毒引起,，人、動(dòng)物與大多數(shù)家禽都可能感染日本腦炎,。在 10 歲以下,，尤 其是 2-6 歲的兒童中傳播廣。主要的癥狀為發(fā)燒,、抽筋與深度昏迷,。超過(guò)一半 的存活兒童，在發(fā)病一年后仍有腦波之異常,。四分之三的存活者,，在發(fā)病五年后， 仍然有行為或精神狀態(tài)方面之異常,。因此快速靈敏診斷具有重要意義,。本產(chǎn)品就 是以探針?lè)晒舛?RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)檢測(cè)日本腦炎病毒的試劑盒， 它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高,。

3. 提供陽(yáng)性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)日本腦炎病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì),，不會(huì)跟其他病毒的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?RT-PCR 反應(yīng),。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研,。

日本腦炎病毒探針?lè)晒舛縍T-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月,。 

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無(wú)傳染性的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍 頭,，下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供),，充分震 蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

4. 換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品,，設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性 對(duì)照）,，一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,。可以用 10μL 陽(yáng)性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC,。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容,。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用 水做模板）,，1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好 后后加）： 

11. 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

五、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值 為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小 于或等于 35 則為陽(yáng)性,。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,，如果小于 35，則為陽(yáng)性,。