人乳頭瘤病毒16探針法熒光定量PCR試劑盒

Human Papillomavirus 16(HPV-16)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

人乳頭瘤病毒是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒 A 屬，是球形 DNA 病毒,，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖,。表現(xiàn)為尋常疣、生殖器疣（尖銳濕 疣）等癥狀,。 隨著性病中尖銳濕疣的發(fā)病率急速上升和宮頸癌,、肛門癌等的增 多，人乳頭瘤病毒（hpv）感染越來越引起人們的關(guān)注,。HPV16 是高危型病毒,， 有宮頸癌傾向，是癌前病變,。因此快速檢測人乳頭瘤病毒 16 具有重要意義,。本 產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高,。
3. 提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)人乳頭瘤病毒 16 高度保守區(qū)設(shè)計(jì),，不會跟其他微生 物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng),。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研,。

人乳頭瘤病毒16探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存,，有效期一年,。

自備試劑  樣品 DNA。

使用方法 一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭,， 下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品,，好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性 對照）,，一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對照）,。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC,。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容,。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用 水做模板）,，1 個(gè)用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后后加）：

11.蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值 為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小 于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,，則重復(fù)一次,。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰,，該樣本判斷為陽性,，否則為陰性。