人皰疹病毒6型探針法熒光定量PCR試劑盒

Human Herpesvirus-6(HHV-6)

產(chǎn)品及特點

人皰疹病毒 6 型（Human Herpesvirus-6,HHV-6）是從淋巴增生性疾病 和艾滋病患者淋巴細(xì)胞中培養(yǎng)獲得的一種新病毒，可通過唾液飛沫及密切接觸 （如接吻,，共用餐,、飲器具等）,、輸血傳播。除免疫低下（如先天性 免疫缺陷,、艾滋病,、長期服用免疫抑制劑等）外，絕大多數(shù)人感染后終身都不會 產(chǎn)生明顯癥狀,；免疫低下者,，如 HIV 感染者，當(dāng)人體特異性免疫被削弱至一定 程度時,，潛伏的病毒可被激活并產(chǎn)生急性感染癥狀,，此時會出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎、腦 炎,、腦膜炎,、肝炎及多器官衰竭等癥狀，活化的病毒可大規(guī)模感染 T 淋巴細(xì)胞,， 使免疫功能進(jìn)一步削弱,，該病毒對人體健康有較大影響。本產(chǎn)品就是以探針法熒 光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā),，專門檢測人皰疹病毒 6 型的試劑盒,，它具有下列 特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高。
3. 提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4. 特異性高，引物是根據(jù)人皰疹病毒 6 型高度保守區(qū)設(shè)計,，不會跟其他病毒的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng),。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研,。

人皰疹病毒6型探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸,、-20℃保存，有效期一年,。

自備試劑  樣品 DNA,。

使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭， 下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

5. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品,，好設(shè)置 N+2 個提取,，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照）,，一個是 NC（樣品制備陰性對照）,。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC,。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容,。

三,、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用 水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后后加）：

11.蓋上蓋子后上機,，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

四,、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值 為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度,。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小 于或等于 35 則為陽性,。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次,。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40,，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性,。