豬霍亂病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Hog Cholera Virus

產(chǎn)品及特點(diǎn)

豬霍亂病毒(Hog Cholera Virus）是一種RNA病毒,，會(huì)引起豬霍亂，俗稱豬瘟,，是一種急性,、高傳染性和對(duì)豬致命性的疾病，病豬消沉,、發(fā)高燒,、虛弱、食欲不良,、神經(jīng)緊張,，在腹部、腋下和大腿內(nèi)側(cè)會(huì)出現(xiàn)紅斑狀的損傷,。大多數(shù)豬出現(xiàn)上述病癥后不到10天就死亡,。在患病豬群中存活下來的豬，腸和肺都有損傷的痕跡。即使感染減毒豬霍亂病毒的豬,，也會(huì)患慢性豬霍亂,。如果母豬在懷孕期感染了豬霍亂病毒或接種了活病毒疫苗，就會(huì)使胎豬發(fā)生變異,，因此豬霍亂病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用,。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn)：

1.一站式,，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,，包括引物和對(duì)照,。
2.根據(jù)豬霍亂病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物,，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測(cè),，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍,，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù),，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成,，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染,。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR,，只能用于科研，不能用于臨床,。

豬霍亂病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存,，保存期限為12個(gè)月,。陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供RNA段作為陽(yáng)性對(duì)照,。

自備試劑  樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非 常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑 盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣 品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無傳染性的的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 7，6，5,，4,，3，2,。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒 光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭，下同）,。

2. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供),，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。

3. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用,。

4. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用。

5. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。 二、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個(gè)樣品,，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,?？梢杂?10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照 梯度稀釋液中的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝） 再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品 體積多少取決于所用試劑盒的要求）,。可以用水作為制備的陰性對(duì)照,。

7. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。 

三,、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

8. 如果只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照,，6 個(gè)用于 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照。 9. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分： 

9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）,。

四、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值,，再推算出其濃度。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性,。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽(yáng)性