漢坦病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Hantavirus(HV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

漢坦病毒歸屬布尼亞病毒科，是一種有包膜分節(jié)段的負(fù)鏈 RNA 病毒,，基因組 包括 L,、M、S 3 個(gè)片段,，分別編碼 L 聚合酶蛋白,、G1 和 G2 糖蛋白,、核蛋白。 漢坦病毒可兩種：引起漢坦病毒肺綜合征（HPS）,，另一種引起漢坦病毒腎綜合征 出血熱（HFRS）,。前者主要流行于美國，在阿根廷,、巴西,、巴拉圭、玻利維亞以 及德國也發(fā)現(xiàn)了病例,。中國雖未發(fā)現(xiàn),，但有發(fā)生的可能。因此漢坦病毒的快速準(zhǔn)確 鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用,。本產(chǎn)品是基于染料法熒光定量 PCR 原理 開發(fā),，專門檢測漢坦病毒的通用試劑盒。它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式,，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,，包括引物和對照。

2. 根據(jù)漢坦病毒保守基因序列設(shè)計(jì)的引物,，具有良好的特異性,。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍,，可以達(dá) 到至少 1000 拷貝/反應(yīng),。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成,，不需要中 間轉(zhuǎn)移樣品,，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR,，只能用于科研，不能用于臨床,。

漢坦病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月,。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置,。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供RNA段作為陽性對照,。

自備試劑  樣品RNA

使用方法 一,、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非 常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑 盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣 品做陽性對照,，只提供無傳染性的的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒 光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),，充分 震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用,。

3. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用,。

5. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對照。放冰上待用,。 二,、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性 對照）,，一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照 梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL,，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝） 再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品 體積多少取決于所用試劑盒的要求）,?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

7. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提 取試劑盒兼容,。 

三,、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

8. 如果只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對照,，6 個(gè)用于 RT-PCR 陽性對照,。 9. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分： 

10. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）,。

四,、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40，則為陽性,。