睡眠嗜血桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

Haemophilus somnus

產(chǎn)品及特點(diǎn)

睡眠嗜血桿菌（Haemophilus somnus）是條件性致病菌,，飼養(yǎng)密集或感 染其他疾病時(shí)，常會(huì)發(fā)生睡眠嗜血桿菌病,，主要表現(xiàn)是血栓性腦膜腦炎 （thrombotic meningoencephalitis,，TME）。除引起牛發(fā)生敗血癥,、血栓性 腦膜炎,、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、血管炎,、流產(chǎn)和不育外,，還可感染綿羊、北美野牛和大 角羊,。睡眠嗜血桿菌歸屬為巴氏桿菌屬,，是一種兼性厭氧，無芽孢和鞭毛的革蘭 氏陰性球桿菌,。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè) 睡眠嗜血桿菌的試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高。

3. 提供陽性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4. 特異性高，引物是根據(jù)睡眠嗜血桿菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì),，不會(huì)跟其他病原 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng),。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研,。 

睡眠嗜血桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑   樣品 DNA,。

使用方法 一,、稀釋 PCR 陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽性對(duì)照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千 萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病 原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽 性對(duì)照,。

2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）,。

4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照,。放冰上待用,。

6. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中,，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照,。放冰上待用,。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照）,， 一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL PCR 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋 的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL,，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝,，可以將 10μL 原 液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻,，此為 100 倍稀釋液,。再取 10μL 此 稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻,，此為 10000 倍稀釋液）再加 上一定量的水作為制備的陽性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品體積多少取 決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照,。制備所得成為樣品 DNA。

9. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼 容,。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上 步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性 分析,，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）,，1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用 第 4 號(hào)陽性對(duì)照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）,。下面只描述定量分析的步驟,， 定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)，其余不變,。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢 后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。

四,、數(shù)據(jù)處理

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽性或陰性,，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等 于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于或等于 35 則為 陽性。如果在 35-40 之間,，則重復(fù)一次,。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴(kuò)增曲線有 明顯起峰,，該樣本判斷為陽性,，否則為陰性。