口蹄疫病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV）會(huì)引發(fā)口蹄疫,， 易感染的動(dòng)物是黃牛等；野生動(dòng)物也易感染此病,?？谔阋咴趤喼蕖⒎侵藓椭袞|以 及南美均有流行,，口蹄疫發(fā)病后一般不致死,，但會(huì)使病獸的口、蹄部出現(xiàn)大量水 皰,， 高燒不退,，使實(shí)際畜產(chǎn)量銳減。另外,，有個(gè)別口蹄疫病毒的變種可傳染給人,。 因此，每次爆發(fā)后只能屠宰和集體焚毀染病牲畜以*患,。由于口蹄疫傳播迅速,、 難于防治、補(bǔ)救措施少,，被稱為畜牧業(yè)的“*殺手”,，因此口蹄疫病毒的快速 準(zhǔn)確鑒定有著重要意義。本產(chǎn)品基于 PCR 原理開發(fā),。它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式,，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照,。

2. 根據(jù)口蹄疫病毒保守基因序列設(shè)計(jì)的引物,，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測(cè),，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍,，可以達(dá) 到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù),，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成,，不需要中 間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染,。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR,，只能用于科研，不能用于臨床,。

口蹄疫病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月,。陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置,。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供RNA段作為陽(yáng)性對(duì)照,。

自備試劑  樣品RNA

使用方法 一,、稀釋陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非 常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑 盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣 品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無(wú)傳染性的的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒 光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭，下同）,。

2. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供),，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。

3. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。

4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用,。

5. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。 二、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個(gè)樣品,，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,?？梢杂?10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照 梯度稀釋液中的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝） 再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品 體積多少取決于所用試劑盒的要求）,。可以用水作為制備的陰性對(duì)照,。

7. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。 

三,、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

8. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照,。 9. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分： 

10. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）。

四,、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度,。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性,。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40,，則為陽(yáng)性,。