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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0324	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴(kuò)增效率,、更高的擴(kuò)增靈敏度,、更高的擴(kuò)增特異性。

貓白血病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Feline Leukemia Virus(FeLV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

貓白血病病毒（Feline Leukemia Virus, FELV）會引起貓白血病,，貓白血病是一種貓常見的非創(chuàng)傷性致死疾病,，也是一種惡性腫瘤性傳染病,，而且本病目前尚無有效的治療方法，對貓的健康造成嚴(yán)重?fù)p害,，因此快速檢測貓白血病病毒具有重要意義,。本產(chǎn)品基于熒光定量 RT-PCR 原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照,。

2. 根據(jù) FELV 的保守基因序列設(shè)計的引物,，具有良好的特異性和亞型涵蓋性（可擴(kuò) A、B,、C 三種 FELV 亞型），但又不會與其他病毒樣品發(fā)生交叉反應(yīng)。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測,，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá) 到至少 1000 拷貝/反應(yīng),。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù),，RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,，降低了操作誤差和可能的污染,。

5. 提供陽性對照，便于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。

6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR,，只能用于科研，不能用于臨床,。

貓白血病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成份	規(guī)格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL（棕色管）
試劑二	10×qRT-PCR酶混合液	100 μL（紅蓋）
試劑三	ROX染料I	50 μL（棕色管）
試劑四	ROX染料II	50 μL（棕色管）
試劑五	熒光PCR模板稀釋液	1mL（亮黃蓋）
試劑六	貓白血病病毒RT-PCR引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑七	貓白血病病毒RT-PCR陽性對照（1×10E8拷貝/μL）	50 μL（黃蓋）
試劑八	RNA 病毒裂解液（試用裝）	15 次（9mL）
試劑九	使用手冊	1份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置,。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供RNA段作為陽性對照。

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一,、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用,。

3. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用,。

5. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用,。二,、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）,，一個是 NC（樣品制備陰性對照）,。可以用 10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL,，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

7. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容,。

三,、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

8. 如果只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照,，6 個用于 RT-PCR 陽性對照,。 9. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

成分	N+2個制備所得樣品	RT-PCR陰性對照	RT-PCR陽性對照（2-7管）
2×qRT-PCR 緩沖液	10μL	10μL	各10μL
貓白血病病毒RT-PCR 引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (見注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
樣品制備所得RNA模板（來于第8步）	5.6μL	不加	不加
稀釋所得6個陽性對照（來于第6步）	不加	不加	各5.6μL（2號樣到2號管,，3號樣到3號管…）
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

10. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）,。

過程	溫度	時間
RT（逆轉(zhuǎn)錄）	50℃	30分鐘
預(yù)變性	94℃	2分鐘
RT - PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)）	95℃	15 秒
RT - PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)）	60℃	15 秒（采集FAM通道的熒光信號）
按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值,，再推算出其濃度。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性,。