馬皰疹病毒1型染料法熒光定量PCR試劑盒

Equine Herpesvirus 1 (EHV-1)

產(chǎn)品及特點

皰疹病毒（herpes virus）是一群有包膜的 DNA 病毒，生物學特性相似,，歸類為 皰疹病毒科（Herpesviridae）,。其感染宿主廣泛，主要侵害皮膚,、黏膜以及神經(jīng)組 織,，嚴重影響著人及其他動物的健康。馬可能感染多種皰疹病毒,。常見的與感冒病 毒相似,，易致呼吸困難。而金溪馬術(shù)中心發(fā)現(xiàn)的是罕見卻嚴重的馬皰疹病毒 1 型 （EHV-1）,。它會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng),，可引起步態(tài)不穩(wěn)、無法排尿,、尾部下垂及無法 站立,。年齡偏大、易感的馬匹可能無法存活,。馬皰疹病毒 1 型(EHV-1)經(jīng)感染甚至重 復感染馬后產(chǎn)生的免疫力是短期的,且馬在一生中可以受到幾次感染,。因此靈敏快捷的 診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本公司產(chǎn)品開發(fā)馬皰疹病毒 1 型染料法熒光定量 PCR 試 劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用,，用戶只需要提供病毒 DNA 模板,。

2. 引物根據(jù)馬皰疹病毒 1 型專一區(qū)設計，特異性高,。

3. 熒光定量 PCR 檢測,，比常規(guī) PCR 更加靈敏。

4. 一管式閉管操作,，降低了交叉污染,。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷,。

馬皰疹病毒1型染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA,。

使用方法 一,、制備標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭,， 下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提 供),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有 N 個樣品,，則需要進行 N+2 個樣品提取,，多出的一個用作樣品制備 陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管,。

三,、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果進行定量分析,，則標記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照,，6 個用于標準曲線樣品,。如果做定 性分析，則 6 個標準曲線樣品只選一個做（可以選 4 號,，其余樣品不變）,。 以下只介紹定量分析的反應設置。

10. 在標記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機,，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

四,、熒光定量 PCR 反應參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

12. 設定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析,，排除假陽性,。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標準曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 32,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線，Ct 值應該 小于或等于 30,。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 32 則為陰性，如果小 于或等于 30 則為陽性,。如果在 30-32 之間,，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 32 則為陰性,，如果小于 30,，則為陽性。