艾特韋病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Egtved Virus

產品及特點

艾特韋病毒(Egtved Virus)是一種RNA病毒，會引發(fā)病毒性出血癥,，主要癥狀病魚體表兩側出血,，上下額、吻部出血,，胸鰭,、背鰭基部充血,，嚴重時患魚部分鱗片脫落，有的潰瘍,，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失,，因此艾特韋病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產品基于PCR原理開發(fā),。它具有下列特點：

1.一站式,，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照,。
2.根據(jù)艾特韋病毒的保守基因序列設計的引物,，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測,，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍,，可以達到至少1000拷貝/反應。
4.使用一管式qRT-PCR技術,，RT和PCR兩步在一個試管內完成,，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染,。
5.本產品足夠50次30μL體系的RT-PCR,，只能用于科研，不能用于臨床,。

艾特韋病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存,，保存期限為12個月,。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供DNA段作為陽性對照,。

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例,。由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,。
1.標記6個離心管,，分別為7，6,，5,，4，3,，2,。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液,，用帶芯槍頭，下同）,。
2.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
3.換槍頭,，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
4.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用。
二,、樣品RNA的制備
5.如果有N個樣品,，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照）,，一個是NC（樣品制備陰性對照）,。可以用10μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL,，10μL相當于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6.用自選方法純化N+2個樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容,。
三,、設置RT-PCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
7.如果做定量分析并且只做1次重復,，則標記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照,，6個用于標準曲線,。如果做定性分析,，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）,。下面只描述定量分析的步驟,，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變,。
8.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）： 

9.上機后按下面參數(shù)進行RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）,。

四、數(shù)據(jù)處理

10. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大于 或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線,，Ct 值應該小于 或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于或等 于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,，則重復一次