巨細(xì)胞病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

Cytomegalovirus(CMV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus,，CMV）是一種皰疹病毒組 DNA 病毒,。亦 稱細(xì)胞包涵體病毒，由于感染的細(xì)胞腫大,，并具有巨大的核內(nèi)包涵體,。巨細(xì)胞病 毒分布廣泛，其他動(dòng)物皆可遭受感染,，引起以生殖泌尿系統(tǒng),，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝 臟疾患為主的各系統(tǒng)感染，從輕微無癥狀感染直到嚴(yán)重缺陷或死亡,。對(duì)于孕婦或 有慢性消耗性疾病,、免疫力低下等患者要注意保護(hù)。本公司開發(fā)巨細(xì)胞病毒探針 法熒光定量 PCR 試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)： 

1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高,。

3. 提供陽性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)巨細(xì)胞病毒設(shè)計(jì),，不會(huì)跟其他病毒株 DNA 發(fā)生交叉 反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng),。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研,。 

巨細(xì)胞病毒探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存,，有效期一年,。

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定,，具體見使用方法）,。

使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對(duì)照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭,， 下同）,。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

5. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品,，好設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,?？梢杂?10μL 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC,。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容,。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用 水做模板）,，1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。 10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好 后后加）：

11.蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

四,、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值 為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度,。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性,，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 40,。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對(duì)待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小 于或等于 35 則為陽性,。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次,。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40,，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,，否則為陰性,。