牛腎盂腎炎棒桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Corynebacterium renale

產(chǎn)品及特點(diǎn)

腎棒狀桿菌(Corynebacterium Renale)革蘭氏染色陽(yáng)性,，為球桿狀或棍棒 狀，呈單在,、成叢或柵欄樣排列,。細(xì)菌性腎盂腎炎由腎棒狀桿菌引起，主要發(fā)生 于母牛,，公牛少見(jiàn),，馬和綿羊偶可發(fā)生。本病為尿源性感染,，因此病原菌經(jīng)尿道 生殖道口感染后,，先引起尿道炎、膀胱炎,，然后再逆行導(dǎo)致腎盂腎 炎,。由于腎組織損傷與尿液滯留，終病畜可因尿毒癥而死亡,。病牛主要表現(xiàn)發(fā) 熱,，食欲不振，尿頻,，尿少,，尿因混有黏液、膿液,、大量蛋白質(zhì),、膿細(xì)胞和白細(xì) 胞、脫落的上皮細(xì)胞等而渾濁帶血色,。尿液涂片或細(xì)菌培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)病原菌,。嚴(yán)重 病例常發(fā)生尿毒癥。本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門 檢測(cè)牛腎盂腎炎棒桿菌的試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用,，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高,，引物是根據(jù)牛腎盂腎炎棒桿菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他微生物,。

3. 引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍,。

4. 提供無(wú)傳染性的 PCR 陽(yáng)性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作,，熒光 PCR 檢測(cè),，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染,。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR,。

牛腎盂腎炎棒桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存,，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑   樣品 DNA,。

使用方法 一,、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無(wú)傳染性的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭， 下同）,。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL,，試劑盒提 供)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取,，多出的一個(gè)用作樣品制備 陽(yáng)性對(duì)照管,、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。

三,、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。如果做定 性分析,，則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào)，其余樣品不變）,。 以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置,。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）,。

四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五,、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析,，排除假陽(yáng)性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 32。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 32 則為陰性,，如果小 于或等于 30 則為陽(yáng)性,。如果在 30-32 之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 32 則為陰性,，如果小于 30，則為陽(yáng)性,。