豬瘟病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Classical Swine Fever Virus(CSFV)

產(chǎn)品及特點

豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,，CSFV；或稱 Hog Cholera Virus,， HCV）是 ssRNA 病毒,，屬黃病毒科瘟病毒屬，其 RNA 為單股正鏈,。由 CSFV 引起的 豬瘟病是一種急性,、熱性、高度接觸性的傳染病,，廣泛存在于*各養(yǎng) 豬國家,，嚴重 危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。因此豬瘟病毒的快速準確鑒定有著重要意義,。 本產(chǎn)品基于 PCR 原理開發(fā),。它具有下列特點：

1.一站式，用于不需要單獨準備每種成分,，包括引物和對照,。
2.根據(jù)豬瘟病毒的的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性,。
3.基于染料法qRT-PCR檢測,，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應,。
4.使用一管式qRT-PCR技術,，RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,，降低了操作誤差和可能的污染,。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研,，不能用于臨床,。

豬瘟病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置,。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供DNA段作為陽性對照,。

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例,。由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,。
1.標記6個離心管,，分別為7，6,，5,，4，3,，2,。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭,，下同）,。
2.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
3.換槍頭,，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
4.換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用,。
二,、樣品RNA的制備
5.如果有N個樣品，必須設置N+2個提取,，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照）,，一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL,，10μL相當于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6.用自選方法純化N+2個樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容,。
三,、設置RT-PCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
7.如果做定量分析并且只做1次重復,，則標記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照,，6個用于標準曲線,。如果做定性分析，并且只做1次重復,，則標記N+4個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板）,，1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）,。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個,，其余不變,。
8.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）： 

9.上機后按下面參數(shù)進行RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。

四,、數(shù)據(jù)處理

10. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于 或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于 或等于 30,。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等 于 35 則為陽性,。如果在 35-40 之間,，則重復一次