牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR試劑盒

Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

牛 病 毒 性 腹 瀉 - 粘膜病 （ Bovine viral diarrhea-mucosal disease ,， BVD-MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV）引起的以粘膜發(fā)炎,、糜爛,、壞死和腹瀉等特征為主的疾病。該病 在世界各地廣泛流行和傳播,，一些畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家尤其嚴(yán)重,。因此，BVDV 的 快速準(zhǔn)確鑒定,，對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。為此本公司開(kāi)發(fā)了本產(chǎn)品,， 采用 qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)疑似感染動(dòng)物血清或組織中的 BVDV,。它具有下列特點(diǎn)：

1.一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,，包括引物和對(duì)照,。
2.根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性,。
3.基于染料法qRT-PCR檢測(cè),，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍,，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù),，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成,，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染,。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR,，只能用于科研，不能用于臨床,。

牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存,，保存期限為12個(gè)月,。陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供DNA段作為陽(yáng)性對(duì)照,。

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7這6個(gè)10倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,。
1.標(biāo)記6個(gè)離心管,，分別為7，6,，5,，4，3,，2,。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭,，下同）,。
2.在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用。
3.換槍頭,，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。
4.換槍頭,，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。
二、樣品RNA的制備
5.如果有N個(gè)樣品,，必須設(shè)置N+2個(gè)提取,，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）,?？梢杂?0μL上步制備的陽(yáng)性對(duì)照梯度稀釋液中的第4號(hào)（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）,。可以用水作為制備的陰性對(duì)照,。
6.用自選方法純化N+2個(gè)樣品的RNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。
三,、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行）
7.如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析,，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（用第4號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）,。下面只描述定量分析的步驟,，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè)，其余不變,。
8.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）： 

9.上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）,。

四、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40,，則為陽(yáng)性,。