牛結節(jié)疹病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

Bovine Lumpy Skin Disease Virus(LSDV)

產品及特點

牛結節(jié)疹病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)又牛疙瘩皮膚病毒或牛結節(jié)性 皮膚病病毒,，該病毒的代表株是 Naethling 株,，因此又叫 Naethling 病毒。該病毒 形態(tài)與牛痘苗病毒相似,，它引起的以患牛發(fā)熱,皮膚、黏膜,、器官表面廣泛性結節(jié),，淋 巴結腫大，皮膚水腫為特征的傳染病,，后感染動物消瘦,，產乳量大幅度降低,，嚴重時 導致死亡。該病起源于非洲,，2010 年以來,，確認在此期間曾發(fā)生或正在發(fā)生該病的國 家多達 43 個，分布于非亞歐三大洲,，其中非洲疫情尤為嚴重,。隨著我國與非洲國家交 往的不斷加強，貿易范圍不斷擴大,，該病傳入我國的風險不斷加大,，因此掌握該病 的流行狀況、開展相應的診斷檢測技術研究以及制訂相關技術標準不僅十分必要而且迫 在眉睫,。本產品就是為此目的根據探針法 qPCR 原理開發(fā)的試劑盒,，它具有下列特點： 

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2. 根據牛結節(jié)疹病毒保守區(qū)域設計引物和探針,，能專一性地檢測出樣品中的牛結節(jié)疹 病毒成分，但不能檢測其他非牛結節(jié)疹病毒成分,。

3. 提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作,，降低了交叉污染,。

5. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時,。

6. 本只能用于科研,，足夠 50 次 20uL 體系的探針法熒光定量 PCR。

牛結節(jié)疹病毒探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存，有效期一年,。使用本試劑盒提供的陽性對照時,，由于其濃度較 高，一定要注意不要污染其他試劑和成分,。在專門的區(qū)域操作,。  

自備試劑 DNA 模板 

使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。 由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,， 本產品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍 頭，下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

5. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品,，設置 N+2 個提取,，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC,。另外用水作為 NC,。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容,。

三,、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,，則標記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標準曲線,。如果做定性分析，并且只做 1 次重復,，則標記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用 水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復）： 

四,、qPCR 反應參數

五、數據處理

11. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱 軸，繪制標準曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

12. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大于或等 于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,，有典型擴增曲線,，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于或等于 35 則為 陽性。如果在 35-40 之間,，則重復一次,。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則 為陰性，如果小于 40,，則為陽性,。