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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0102	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴(kuò)增效率、更高的擴(kuò)增靈敏度,、更高的擴(kuò)增特異性,。

巨大芽孢桿菌染料法qPCR試劑盒

Bacillus megaterium

產(chǎn)品及特點(diǎn)

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）：桿狀,，末端圓,，單個或呈短鏈排列。嚴(yán)格好氧 ,，能運(yùn)動,，革蘭氏陽性。芽孢從橢圓形到長形不等,；不能生成乙酰甲基甲醇,；菌株能運(yùn)動，但運(yùn)動緩慢,，需要游離氧。工業(yè)上用于生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu) 酶,，巨大芽孢桿菌在回收貴重金屬方面有著重要作用,，還能降解土壤中難溶的含磷化合物，使之成為作物能吸收的可溶物巨大芽孢桿菌與球形芽孢桿菌混合培養(yǎng) 時具有固氮增效作用,，非常適合制成微生物肥料,。本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測巨大芽孢桿菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用,，用戶只需要提供 DNA 模板,。

2. 特異性高，引物根據(jù)巨大芽孢桿菌高度保守區(qū)設(shè)計,，不會擴(kuò)增其他微生物,。

3. 引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍,。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作,，熒光 PCR 檢測,，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研,，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR,。

巨大芽孢桿菌染料法qPCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×PCR MagicMix	0.5 mL（棕色）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	巨大芽孢桿菌染料法 qPCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	巨大芽孢桿菌染料法 qPCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)	50 μL（黃蓋）
試劑五	天凈沙核酸釋放劑（試用裝）	20 次（1mL，綠蓋）
試劑六	使用手冊	1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,、-20℃保存,，有效期一年,。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法 一,、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL,，試劑盒提供),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

5. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

8. 如果有 N 個樣品,，則需要進(jìn)行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管,、另一個用作樣品制備陰性對照管,。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果進(jìn)行定量分析,，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照,，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定性分析,，則 6 個標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個做（可以選 4 號,，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置,。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

成分	樣品管 N+2 個	PCR 陰性對照管	PCR 陽性對照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
巨大芽孢桿菌染料法混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
自備 10×ROX (見注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 個待測樣品 DNA 模板	6 μL
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號）			各 6μL（2 號樣到 2 號管,，3 號樣到 3 號管…）

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）,。

過程	溫度	時間
預(yù)變性	95℃	10 min
PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)）	95℃	15 sec
PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)）	60℃	1 min（采集 SYBR 通道的熒光信號）

按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行熔解曲線分析

五,、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析，排除假陽性,。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度,。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 35,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30,。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 35 則為陰性,，如果小于或等于 30 則為陽性,。如果在 30-35 之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 35 則為陰性,，如果小于 30,，則為陽性。