蠟樣芽胞桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Bacillus cereus

產品及特點

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），又稱仙人掌桿菌,，是一種革蘭氏陽性 菌,，β溶血性的桿狀細菌。經常在土壤和食物中被發(fā)現,，有些菌株會引起食物中 毒,；另外一些菌株則對其他動物有益。蠟樣芽孢桿菌是兼性厭氧性,。與其他芽孢 桿菌相同,，它會產生防御性的內芽孢,。它的致病因子包括施普善和磷脂酶 C。熒 光定量 PCR 是檢測傳染性疾病的主流技術,，本產品就是以染料法熒光定量 PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測蠟樣芽胞桿菌的試劑盒,，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板,。

2. 特異性高,，引物根據蠟樣芽胞桿菌高度保守區(qū)設計，不會擴增其他細菌,。

3. 引物和擴增體系經過優(yōu)化,，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品,。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測,，不容易產生環(huán)境污染,。

6. 本產品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR,。

蠟樣芽胞桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存,，有效期一年,。

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據機型決定,，具體見使用方法）,。

使用方法 一、制備標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。 由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標記 6 個離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭， 下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL,，試劑盒提 供)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備 7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容,。 8. 如果有 N 個樣品,，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備 陽性對照管,、另一個用作樣品制備陰性對照管,。

三、設置 qPCR 反應（20μL 體系,，在樣品制備室進行）

9. 如果進行定量分析,，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照,，6 個用于標準曲線樣品。如果做定 性分析,，則 6 個標準曲線樣品只選一個做（可以選 4 號,，其余樣品不變）。 以下只介紹定量分析的反應設置,。

10. 在標記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機,，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同 而自行優(yōu)化）。

按儀器預設程序進行熔解曲線分析

五,、數據處理

12. 設定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析,，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,，有典型擴增曲線,，Ct 值應該 小于或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小 于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,，則重復一次,。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40,，則為陽性,。