解淀粉芽孢桿菌染料法qPCR試劑盒

Bacillus amyloliquefaciens

產(chǎn)品及特點

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）為芽孢桿菌屬,，是一種與 枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌,，其在生長過程中可以產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌 和細菌活性的代謝物。本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎開發(fā)的專 門檢測解淀粉芽孢桿菌的試劑盒,，它具有下列特點：

1. 即開即用,，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高,，引物根據(jù)解淀粉芽孢桿菌高度保守區(qū)設計,，不會擴增其他微生物。

3. 引物和擴增體系經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍,。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品,。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測,，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染,。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR,。

解淀粉芽孢桿菌染料法qPCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存,，有效期一年,。

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一,、制備標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA

段作為陽性對照,。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7,，6,，5,，4，3,，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭,， 下同）,。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提 供),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

8. 如果有 N 個樣品,，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備 陽性對照管,、另一個用作樣品制備陰性對照管,。

三、設置 qPCR 反應（20μL 體系,，在樣品制備室進行）

9. 如果進行定量分析,，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照,，6 個用于標準曲線樣品。如果做定 性分析,，則 6 個標準曲線樣品只選一個做（可以選 4 號,，其余樣品不變）,。 以下只介紹定量分析的反應設置。

10. 在標記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機,，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

按儀器預設程序進行熔解曲線分析

五,、數(shù)據(jù)處理

12. 設定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析，排除假陽性,。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標準曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線，Ct 值應該 小于或等于 30,。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽性,。如果在 35-40 之間，則重復一次,。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,，如果小于 35，則為陽性,。