禽正呼腸孤病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

African Horse Sickness Virus(AHSV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

禽正呼腸孤病毒(Avian Orthoreovirus)會(huì)引起禽呼腸孤病毒感染，是雞的 一種傳染性疾病,，可引起雞多種疾病，包括病毒性關(guān)節(jié)炎,、矮小綜合征,、呼吸道 疾病、腸道疾病和所謂吸收不良綜合征,。急性感染時(shí),，可見跛行，有些雞發(fā)育不 良,。慢性感染跛行更顯著,，有一小部分病雞的踝關(guān)節(jié)不能活動(dòng)。有時(shí)可能看不到 關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎的臨診癥狀,，但在屠宰時(shí)可見趾屈肌腱區(qū)域腫大,。這樣的雞群增 重慢，飼料轉(zhuǎn)換率低,，總死亡率高,。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù) 為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測禽正呼腸孤病毒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 RNA 模板,。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高,。

3. 提供陽性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)禽正呼腸孤病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì),，不會(huì)跟其他病毒的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng),。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研,。

禽正呼腸孤病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存,，保存期限為 12 個(gè)月,。 

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對(duì)照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液，用帶芯槍 頭,，下同）,。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品,，設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性 對(duì)照）,，一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,。可以用 10μL 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC,。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑 盒兼容,。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout,。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用 水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模 板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。 10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照,，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好 后后加）： 

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR：

五,、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 40,。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對(duì)待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽性,。如果在 35-40 之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40,，則為陽性,。