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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0059	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性,。

星狀病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Astrovirus(AV)

產(chǎn)品及特點

星狀病毒(Astrovirus,，AV) 可以引起幼小動物產(chǎn)生腹瀉癥狀，包括哺乳動物屬和禽類屬,。哺乳動物屬根據(jù)宿主的不同分為人星狀病毒,、貓星狀病毒、豬星狀病毒、綿羊星狀病毒以及貂星狀病毒,；禽類星狀病毒包括火雞星狀病毒、鳥腎炎病毒,。目前使用的疫苗僅有用于預(yù)防雞星狀病毒疾病,，為滅活苗。人類星狀病毒疾病的疫苗至今沒有研制成功,，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義,。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點：

1.一站式,，用于不需要單獨準(zhǔn)備每種成分,，包括引物和對照。
2.根據(jù)星狀病毒的保守基因序列設(shè)計的引物,，具有良好的特異性,。
3.基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍,，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng),。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成,，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR,，只能用于科研,，不能用于臨床。

星狀病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL（棕色管）
試劑二	10×qRT-PCR酶混合液	100 μL（紅蓋
試劑三	ROX染料I	50 μL（棕色管）
試劑四	ROX染料II	50 μL（棕色管）
試劑五	熒光PCR模板稀釋液	1mL（亮黃蓋）
試劑六	星狀病毒RT-PCR引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑七	星狀病毒RT-PCR陽性對照（1×10E8拷貝/μL）	50 μL（黃蓋）
試劑八	天凈沙核酸釋放劑試用裝	20次（1mL,，綠蓋）
試劑九	使用手冊	1份

運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存，保存期限為12個月,。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置,。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供DNA段作為陽性對照,。

樣品RNA

使用方法 一,、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。
1.標(biāo)記6個離心管,，分別為7,，6，5，4,，3,，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）。
2.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。
3.換槍頭,，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
4.換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用,。
二,、樣品RNA的制備
5.如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取,，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照）,，一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL,，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）,?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡?br />6.用自選方法純化N+2個樣品的RNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容,。
三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進行）
7.如果做定量分析并且只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照,，6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+4個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板）,，1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟,，定性分析只是把6個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個,，其余不變。
在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

成分	N+2個制備所得樣品	RT-PCR陰性對照	RT-PCR陽性對照（2-7管）
2×qRT-PCR 緩沖液	10μL	10μL	各10μL
口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (見注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
樣品制備所得RNA模板（來于第8步）	5.6μL	不加	不加
稀釋所得6個陽性對照（來于第6步）	不加	不加	各5.6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

9.上機后按下面參數(shù)進行RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）,。

過程	溫度	時間
RT（逆轉(zhuǎn)錄）	50℃	15-30分鐘
預(yù)變性	94℃	2分鐘
RT - PCR反應(yīng) （30個循環(huán)）	95℃	15 秒
	60℃	15 秒（采集FAM通道的熒光信號）
	72℃	15 秒
按儀器預(yù)設(shè)程序進行溶解曲線分析

四,、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。
如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40，則為陽性,。