曲霉屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒

Aspergillus spp. 

產(chǎn)品及特點(diǎn)

曲霉屬，曲霉目中的一屬,，包括米曲霉,、黑曲霉等。一方面有很多菌種可被 用于各種有益物質(zhì)的生產(chǎn),，如用于蛋白消化劑的蛋白酶（醬油曲霉）,、檸檬酸（黑 曲霉）、衣康酸（土曲霉,、解烏頭酸曲霉）以及曲酸（黃曲霉）等,。但另一方面， 也有不少侵害家禽,、家畜甚至人體內(nèi)臟特別是呼吸器官的病菌,，如引起曲霉癥的 煙曲霉等。因此快速靈敏檢測曲霉屬具有重要意義,。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定 量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測曲霉屬的通用試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高。

3. 提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4. 特異性高，引物是根據(jù)曲霉屬高度保守區(qū)設(shè)計(jì),。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng),。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

曲霉屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存,，保存期限為 12 個(gè)月。 

自備試劑 樣品 DNA,。

使用方法 一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7,，6,，5，4,，3,，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍 頭，下同）,。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

5. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品,，設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性 對照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC。另外用水作為 NC,。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三,、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用 水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對照（用第 4 號(hào)管的陽性對照稀釋液做模 板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好 后后加）： 

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

四,、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值 為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30,。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽性,。如果在 35-40 之間,，則重復(fù)一次,。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰,，該樣本判斷為陽性,，否則為陰性。