米曲霉通用型染料法熒光定量PCR試劑盒

Aspergillus oryzae

產(chǎn)品及特點

米曲霉（Aspergillus oryzae）屬于黃曲霉群,，是曲霉屬中的一個常見種,。分布甚 廣，主要在糧食,、發(fā)酵食品,、有機物和土壤等處,。是我國傳統(tǒng)釀造食品醬和醬油 的生產(chǎn)菌種。也可生產(chǎn)淀粉酶,、蛋白酶,、果膠酶。本公司開發(fā)米曲霉通用型染料法熒 光定量 PCR 試劑盒,，它具有下列特點：

1. 即開即用,，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 引物根據(jù)米曲霉通用專一區(qū)設計,，特異性高,。

3. 熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏,。

4. 一管式閉管操作,，降低了交叉污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR,。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷。 

米曲霉通用型染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸,、-20℃保存,，有效期一年。

自備試劑 DNA 模板,、10×ROX（根據(jù)機型決定,，具體見使用方法）。

使用方法 一,、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬 不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽性對 照,。

2. 標記 6 個離心管,，分別為 7，6,，5,，4，3,，2,。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）,。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用,。

5. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用。

6. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用,。

7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用,。

二,、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取,，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）,， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL,，10μL 相當于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求 的體積一樣,，以此作為 PC,。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品,， 則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL,。

9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容,。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout,。

三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系,，在樣品制備室進行）

10. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個 樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照,。如果做 2-3 次重復,，則 反應設置數(shù)量相應增加 2 或 3 倍,。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢 后才設置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）： 

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）,。

按儀器預設程序進行熔解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱 軸，繪制標準曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大于或等 于 33。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線,，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,，如果其 Ct 大于或等于 33 則為陰性,，如果小于或等于 33 則為 陽性。