MKN-45-LUC-eGFP（人胃癌細(xì)胞-綠色熒光蛋白-熒光素酶標(biāo)記）

細(xì)胞篩選：

該細(xì)胞為已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LUC-eGFP的細(xì)胞,，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其LUC-eGFP熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱,。若實(shí)驗(yàn)要求需要維持熒光強(qiáng)度，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選,。

細(xì)胞經(jīng)過20μg/ml嘌呤霉素篩選,，平時(shí)培養(yǎng)可維持10μg/ml嘌呤霉素

二、細(xì)胞接收后的處理

1) 收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于室溫放置約1h,，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們,。

2) 請?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù),。

3) 半貼細(xì)胞和貼壁不牢（懸浮）細(xì)胞：T25瓶置于室溫放置約1h,，顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況,，若細(xì)胞密度在60%以下，客戶需收集T25瓶中的懸浮細(xì)胞離心后用培養(yǎng)基重懸后打回到原培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),，若細(xì)胞生長80%-90%對細(xì)胞進(jìn)行傳代,，傳代時(shí)需要收集培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞離心后回收。

4) 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞,，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

三,、細(xì)胞培養(yǎng)操作

1) 復(fù)蘇細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考,，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含8mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心5min,，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜,。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2) 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

【該細(xì)胞為懸浮和輕微的貼壁細(xì)胞，傳代可以參考以下方法：】

a) 收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中,。用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤洗后細(xì)胞會(huì)脫落所以PBS也要回收到離心管中,。

b) 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL,，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入5-6ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

c) 將收集到的懸浮細(xì)胞,、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min,，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中,，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力,，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3) 細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。下面 T25 瓶為例,；

a) 收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中,，1000 rpm條件下離心4 min,，棄去上清液，用PBS清洗一遍,，棄盡PBS,，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b) 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液,，使細(xì)胞密度1×10^6~1×10^7/mL,，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液,，注意凍存管做好標(biāo)識(shí),。

c) 將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存,。記錄凍存管位置以便下次拿取,。

四、培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1) 細(xì)胞出現(xiàn)問題,，予以重發(fā)情況

a) 細(xì)胞運(yùn)輸途中遭遇的各種問題,，細(xì)胞丟失、瓶身破損,、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等,，重發(fā)；

b) 細(xì)胞污染問題,，請?jiān)谑盏疆a(chǎn)品3 天內(nèi),，給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，核實(shí)后重發(fā),；

c) 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置2小時(shí)后,，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后2 天后，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活,，（需提供真實(shí)清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片）,，重發(fā)；

d) 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后2天后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置2 小時(shí)候并且未開封,，出現(xiàn)污染，重發(fā),；

e) 細(xì)胞活性問題,，請?jiān)谑盏疆a(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力,，和每天的細(xì)胞照片,，核實(shí)后予重發(fā),；

f) 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3 天請拍照，3 天未告知的,，視為產(chǎn)品合格,。4-7 天內(nèi)出現(xiàn)問題需提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問題的照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟，并跟技術(shù)人員溝通的,，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,，重發(fā)。 

2) 細(xì)胞出現(xiàn)問題,，不予以重發(fā)的情況

a) 客戶操作造成細(xì)胞污染,，不重發(fā)；

b) 客戶嚴(yán)重操作失誤致細(xì)胞狀態(tài)不好,，不重發(fā),；

c) 非我們推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā),；

d) 細(xì)胞狀態(tài)不好,，未提供真實(shí)清晰的培養(yǎng)前3 天的細(xì)胞狀態(tài)照片，不重發(fā),；

e) 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)經(jīng)其它處理導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題的,，不重發(fā)；

f) 收到細(xì)胞并發(fā)現(xiàn)問題與客服人員溝通的時(shí)間證明大于7 天的,，不重發(fā),；

g) 視具體情況而定

五、注意事項(xiàng)

1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級生物安全臺(tái)內(nèi)操作,，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套,、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會(huì)泄漏,，并會(huì)慢慢充滿液氮,。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子,，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害,。

3. 該細(xì)胞僅供科研使用！說明書僅供參考以實(shí)際到貨說明書為準(zhǔn),！

僅用于科研,，不能用于臨床診斷！所有產(chǎn)品僅供科研使用,，不得用于人或動(dòng)物的治療等任何其他用途,，不為任何個(gè)人提供產(chǎn)品和服務(wù),。以實(shí)際收貨產(chǎn)品說明書為準(zhǔn)，網(wǎng)站說明書僅供參考,。