免疫組化染色過程中存在的問題

良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提,。由于免疫組化染色過程中存在很多步驟或環(huán) 節(jié),，每一個(gè)步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的zui終結(jié)果,，因此,，要做好一張高質(zhì)量的免疫組化切片并不是一 件非常容易的事,。需要病理技術(shù)員和病理醫(yī)生密切配合,、相互協(xié)調(diào),、共同努力才能保證做出合格的免疫組 化切片,。雖然免疫組化染色可以存在各種各樣的問題,，但從染色的結(jié)果看，一般可分為兩類：無色片（即 無陽性信號(hào)）和“雜音”染色片（有陽性信號(hào)）,。 一,、 無色片 染色結(jié)束后，切片中見不到任何陽性信號(hào),。這是常規(guī)工作中比較常見的現(xiàn)象,，出現(xiàn)這種現(xiàn)象,，有兩種可能： 1、真陰性結(jié)果：整個(gè)染色過程沒有出現(xiàn)問題,，組織或細(xì)胞確實(shí)不表達(dá)與抗體相關(guān)的抗原,。2、假陰性結(jié)果： 即此陰性結(jié)果不是真實(shí)的反映,。假陰性結(jié)果又可分為兩種情況：（1）,、切片中根本就不包含所預(yù)期檢查的組 織或細(xì)胞。出現(xiàn)這種情況,，要麼是病理醫(yī)生選擇錯(cuò)了切片或抗體選錯(cuò)了,，要麼是技術(shù)員選錯(cuò)了蠟塊。獲得 正確的切片進(jìn)行染色是獲得正確結(jié)果的前提,。由此表明：制作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術(shù)員的事,， 病理醫(yī)生也起著*的作用。（2）,、染色過程中的某一或某些環(huán)節(jié)出了問題,。比如，組織未進(jìn)行抗原修 復(fù),，有的組織必須經(jīng)過抗原修復(fù)才能檢測(cè)抗原表達(dá),；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織 的抗體；或一抗失效,，雖然抗體失效在理論上是一個(gè)逐漸的過程,，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長(zhǎng) 期不用和/或已超過有效期是主要的原因,。也可見于染色過程中漏掉了某一環(huán)節(jié),，如忘記加二抗或三抗，或 用了兩次二抗而缺少了三抗,，或配制 DAB 時(shí)少了過氧化氫,。為了避免這種簡(jiǎn)單的錯(cuò)誤，有一種簡(jiǎn)單的方法： 在三抗孵育結(jié)束時(shí),，將切片上的三抗甩在一張白紙上,，在將配制好的 DAB 滴一滴在白紙的三抗上，觀察是 否出現(xiàn)棕色,。如果出現(xiàn)了,，證明三抗和 DAB 的配制過程沒有錯(cuò)誤。如果這種 DAB 再滴到切片上沒有出現(xiàn) 任何陽性信號(hào),，問題一定是出在三抗以前,。如果紙上不出現(xiàn)棕色反應(yīng)，問題肯定在三抗 DAB 或 DAB 的配 制過程。這種簡(jiǎn)單方法能迅速的幫助我們查找出現(xiàn)問題可能的原因,。 解決陰性染色的問題非常簡(jiǎn)單,，就是設(shè)立“陽性對(duì)照”。如果陽性對(duì)照有了表達(dá),，說明染色的全過程 和所有試劑都沒有問題,。如果此時(shí)測(cè)試片仍為陰性，便是真實(shí)的陰性,，說明組織或細(xì)胞沒有相應(yīng)的抗原表 達(dá),。反之，如果陽性對(duì)照沒有著色,，表明染色過程中某個(gè)或某些步驟出了問題或試劑出了問題,。應(yīng)一一尋 找原因。陽性對(duì)照包括兩種,，一種稱為“自身對(duì)照”或“內(nèi)部對(duì)照”,，這是指在測(cè)試的切片中本身就存在 已知的抗原，如正常淋巴結(jié)中存在 T 和 B 細(xì)胞抗原,，CD20或 CD3都應(yīng)該有表達(dá),。自身對(duì)照是一種比較理想 的對(duì)照，對(duì)照和測(cè)試組織或細(xì)胞都在同一張切片中,，都處于相同的試驗(yàn)條件下,，結(jié)果更可靠也更具有可比 性。在選擇自身對(duì)照片時(shí)選擇既有病變組織同時(shí)又有正常組織的部分,，這樣有利于對(duì)比。另一種稱為 “外部對(duì)照”,，有時(shí)在測(cè)試的切片中不存在已知的抗原,，如在胃的標(biāo)本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用 HMB45或 Mart-1來檢測(cè),，在正常的胃組織中本身不存在相關(guān)的抗原,，如果病變出現(xiàn)陽性反應(yīng)結(jié)果，尚能提 示是惡黑,，但是如果出現(xiàn)陰性結(jié)果,，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術(shù)問題,。因此,， 應(yīng)另外設(shè)立一個(gè)已知的陽性對(duì)照。這種在測(cè)試組織之外的陽性對(duì)照稱為“外部對(duì)照”,。在實(shí)際工作中需要 設(shè)立外部對(duì)照的情況很多,，如果每一種抗體都要選不同的陽性對(duì)照，工作量會(huì)很大。為了解決這個(gè)問題,， 目前國(guó)內(nèi)外有單位將多種不同組織集成在一起,，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片,、組織芯片等,， 其連續(xù)切片儲(chǔ)備待用，需要時(shí)取出一張便可作為陽性對(duì)照,。另外,，比較簡(jiǎn)單的方法，是采用闌尾作為陽性 對(duì)照,，因?yàn)榕c人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多,，如有上皮、淋巴組織,、平滑肌,、間質(zhì)、神 ,、血管,、間皮等。一張闌尾切片可以檢測(cè)大多數(shù)常用的抗體,。 設(shè)立陽性對(duì)照是病理醫(yī)生的任務(wù)或責(zé)任,，而不是技術(shù)員的責(zé)任。病理醫(yī)生觀察了 HE 切片,，了解切片中 是否有自身對(duì)照,，如果沒有，就應(yīng)告訴技術(shù)員采用陽性對(duì)照,。因此,，病理醫(yī)生在免疫組化中的作用是不可 忽視的。 抗體未覆蓋上測(cè)試組織：當(dāng)多塊散開的小組織染色時(shí),，可能漏掉某塊組織染色,。 二、“雜音”染色片 免疫組化除正常的真實(shí)的陽性信號(hào)外常常會(huì)遇到不正常的背景著色,，這些非正常的著色稱為“雜音” 染色,。“雜音”染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣,，為了便于說明,，筆者將其歸納為下面幾種 1、 全片著色 全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色,，著色的強(qiáng)度可深可淺,，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是 陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有： （1） 抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一,。解決辦法是,，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工 作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化,，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度,，既使是即用型的抗體也應(yīng)如 此，不能只簡(jiǎn)單的按說明書進(jìn)行染色,。 （2） 抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是,，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí) 鐘,，及時(shí)提醒,，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高,，要求一抗孵育的 時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí),，而是30分鐘，因此,，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整,。 （3） DAB 變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB 現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用,。配制好的 DAB 不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng),，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與 DAB 產(chǎn)生反應(yīng)而降低 DAB 的 效力,，未用完的 DAB 存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的,。DAB 的顯色在顯微鏡 下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng),。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí),，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)， 但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控,，避免顯色時(shí)間過長(zhǎng)。 （4） 組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體,、染色切片太多,、動(dòng)作太慢、忘記滴液,、滴液流失等 都是造成組織變干的原因,。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周圍畫圈,，可 以有效的避免液體流失,，也能提高操作速度。 （5） 切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在,。有的實(shí)驗(yàn) 室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù),，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在 4ºC 冰箱過夜,，對(duì)結(jié)果無明顯影響,，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天,，會(huì)出現(xiàn)背景著色,，因此， 不可存放時(shí)間太長(zhǎng),。 （6） 一抗變質(zhì),、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色,。用新 買的抗體時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照和用使用過的抗體作比較,。 2、 切片邊緣著色 切片邊緣著色也是一種常見的現(xiàn)象,，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng),。產(chǎn)生的原因： （1） 組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中,，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致,。 解決辦法：制備的膠片（APES 或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片,，不厚于4微米,，組織的前期處 理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織,。 （2） 切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織,，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深,。解 決辦法：試劑要充分覆蓋組織,，應(yīng)超出組織邊緣2 mm。用 DAKO 筆畫圈時(shí),，為了避免油劑的影響,，畫圈應(yīng) 距組織邊緣3-4 mm。 3,、“陰陽臉”著色 指組織一半著色一半無著色,，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結(jié)果。其成因是試劑僅覆蓋了部分 組織而不是全部,。如加試劑后未讓試劑流散開而集中在部分組織上,。通常應(yīng)該在加完試劑后,，仔細(xì)看一遍， 是否有的組織未被試劑*覆蓋,，如有這種情況,，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之 將組織全部覆蓋。另外,，染片盒不平,，切片傾斜，雖然開始試劑已全部覆蓋了組織,，但后來試劑流向一邊,， 部分組織未被試劑覆蓋。對(duì)于這種問題,，只要留心或想到了很容易發(fā)現(xiàn),，也很容易解決。有時(shí),，用 DAKO （或 PAP）筆在組織周圍畫圈時(shí),，劃線太靠近或畫到了組織上，由于筆油的力學(xué)原理,，試劑不能達(dá)到靠近 劃線附近的組織,。還有氣泡也可引起陰陽分明的著色，只是不著色區(qū)域是圓形,，由于氣泡中含氣,，試劑被 推到周圍，因此,，氣泡中心的組織不著色,。解決辦法是滴加試劑時(shí)手法要輕，有氣泡時(shí)用牙簽捅破,。 4,、 灶片狀著色 切片中著色區(qū)東一塊西一塊，呈灶片狀分布,，出現(xiàn)這種問題的原因有： （1） 裱片時(shí)水未排盡,，在局部形成氣泡使組織突起，染色時(shí)試劑滲入后不易洗盡,，顯色過深所致,。解決 辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡,，晾片熱臺(tái)不能平放,，應(yīng)有45度左右的斜度,，利于水流走和蒸發(fā),。 （2） 壞死組織灶,，組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放,、蛋白游離,、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段（如 Fc 段）可能 與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致zui終著色,。解決辦法是在選擇染色切片時(shí)應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片,。 （3） 制作 APES 膠片時(shí)，膠的濃度太高,，干燥后在玻片上留下白色小點(diǎn),，顯色時(shí)白色小點(diǎn)著色。解決辦 法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進(jìn)行,，即5%鹽酸酒精（5ml 鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時(shí),、熱水沖洗玻片 1小時(shí)、蒸餾水洗玻片1分鐘,、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥（室溫）,、2%APES（2 ml APES+98 ml 丙酮） 浸泡玻片5分鐘、玻片過一下丙酮（1-2秒鐘）,、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鐘）,、37°C 過夜干燥、室溫儲(chǔ)存 備用,。如果制片過程中,，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時(shí)可適當(dāng)加入一些丙酮。 5,、 間質(zhì)著色 著色部位主要在間質(zhì),，間質(zhì)著色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團(tuán)相互作用形成非特 異性的連接而著色,，加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結(jié)合,。又如血清中的免疫球蛋白 常常滲出到組織間質(zhì)，很容易與抗體結(jié)合,，造成間質(zhì)著色,，特別是 lambda 和 kappa 染色時(shí)。當(dāng)甲狀腺膠 質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時(shí),，做甲狀腺球蛋白染色也會(huì)出現(xiàn)間質(zhì)著色,。抗體不純或抗體被污染也可出現(xiàn)間質(zhì)著色,， 我們?cè)龅?CD20抗體不純,，除了染上 B 細(xì)胞外還染上了間質(zhì)。 6,、 細(xì)胞漿著色 胞漿著色是所有“雜音”染色中有欺騙性的著色,，著色區(qū)局限在細(xì)胞內(nèi),，間質(zhì)無著色，看上去與 真實(shí)的免疫反應(yīng)著色幾乎一樣,，很難區(qū)別,。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此,，很多非特異性的染色除了見 于間質(zhì)也可以出現(xiàn)在胞漿中,。這種原因造成的著色，可以通過血清封閉解決,。還有因內(nèi)源酶造成的著色,， 如血紅蛋白（紅細(xì)胞）、肌紅蛋白（肌細(xì)胞）,、細(xì)胞色素（粒細(xì)胞,、單核細(xì)胞）、過氧化氫酶（肝,、腎）,，這 些可用過氧化氫進(jìn)行封閉。巨噬細(xì)胞吞噬各種抗原物質(zhì)或 Fc 片斷而出現(xiàn)胞漿著色,，這種著色不易避免,，但 可以通過形態(tài)學(xué)辨認(rèn)出巨噬細(xì)胞而引起重視。內(nèi)源性生物素的著色有欺騙性,，因?yàn)樗鼜V泛的存在于組 織細(xì)胞中,，我們研究結(jié)果顯示：冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素，經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉,， 加熱抗原修復(fù)后造成內(nèi)源性生物素暴露,，內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)度在不同的組織有所不同，從弱陽性（+） 到強(qiáng)陽性（+++）,，內(nèi)源性生物素在組織中的分布形式,，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存 在于胞漿中,，內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織,，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織,，內(nèi)源 性生物素不僅存在人體組織也存在大鼠組織,，內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)弱與修復(fù)液有關(guān)，其強(qiáng)度增加依次為： 檸檬酸,、EDTA,、EGTA，熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉,，非生物素檢測(cè)系統(tǒng) Polymer 兩 步法（EliVision,、EnVision）可避免生物素干擾,。 7、 細(xì)胞核著色 不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色,，如組織在二甲苯里浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（如從星期五浸泡到下星期 一）、緩沖液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng),、組織變干,、微波修復(fù)液的 pH 值和修復(fù)時(shí)間不當(dāng)或修復(fù)過程中修復(fù)液留下得 太少，未沒過組織等,。解決辦法是嚴(yán)格按照操作常規(guī)進(jìn)行工作,。