雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫分析

試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

檢測范圍：                                                          96T

3ng/L -80ng/L 

使用目的：

本試劑盒用于測定雞組織樣本中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量,。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用純化的雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入腫瘤壞死因子α(TNF-α)，再與HRP標記的腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體結合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度,。

試劑盒組成

標本要求

1. 血清：

室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心,。

2. 血漿：

應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成應再次離心,。

尿液：

用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照此實行。

4.細胞培養(yǎng)上清：

檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清。

5.培養(yǎng)細胞:

檢測細胞內的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑,，以使細胞破壞并放出細胞內成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。

6.組織標本:

切割標本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?/span>2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。

7.標本采集后盡早進行提取,，提取按相關文獻進行,，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融

8.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

操作步驟

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

1. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）,、標準孔、待測樣品孔,。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。
2. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。  
3. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
4. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復5次,，拍干,。
5. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外,。
6. 溫育：操作同3,。
7. 洗滌：操作同5。
8. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.
9. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應（此時藍色立轉黃色）,。
10. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行,。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標,，在坐標紙上繪出標準曲線,，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數,；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存,。

2．濃洗滌液可能會有結晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果,。

3．各步加樣均應使用加樣器,，并經常校對其準確性,，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內,，如標本數量多,，推薦使用排槍加樣。

1. 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定,，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）,。
2. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。

6．底物請避光保存,。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理,。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：,；2-8℃,。

2．有效期：6個月