上手蛋白定量實(shí)驗(yàn),，我們有招兒

時(shí)間：2021/12/24閱讀：1513

蛋白定量是生物學(xué)研究中不可能或缺的一個(gè)步驟,，根據(jù)其目的可分為蛋白質(zhì)的“總定量"和特定蛋白的“個(gè)別定量"。在蛋白質(zhì)的提取,、純化和分析過(guò)程中,，蛋白質(zhì)的定量隨處可見(jiàn)。比如在裂解細(xì)胞之后,，應(yīng)對(duì)各個(gè)樣品中的蛋白進(jìn)行定量,，確保下游實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)平行度,；在電泳之前進(jìn)行定量,，保證上樣量一致，這樣目的條帶含量的變化才有說(shuō)服力,。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,、功能各一、分子量存在巨大差異,，目前還沒(méi)有一個(gè)理想且通用的蛋白定分析方法,。如今最常見(jiàn)的方法主要有以下幾種：

BCA法測(cè)定

bicinchonininc acid

原理

BCA(bicinchonininc acid)與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋(píng)果綠,，即 BCA工作試劑,。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+,一個(gè)Cu*螯合二個(gè)BCA分子,，工作試劑由原來(lái)的蘋(píng)果綠形成紫色復(fù)合物，最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比,。

特點(diǎn)

靈敏度高,，檢測(cè)濃度下限達(dá)到25ug/ml，最小檢測(cè)蛋白量達(dá)到0.5ug,，待測(cè)樣品體積為1-20ul ,。
測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS,，5%的Triton x-100,，5%的Tween 20，60,， 80,。
在20-2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。
檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量,。
受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響:EDTA小于10mM,。DTT小于1mM疏基乙醇低于1mm。
BCA法和Commassie法各有優(yōu)勢(shì),，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用,，以消除定量的誤差,。

優(yōu)缺點(diǎn)

操作簡(jiǎn)單，快速,，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定,，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便;
準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好,，BCA 試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200ug/ml ,微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10ug/ml,。
經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外,，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行,，大大節(jié)約樣品和試劑用量;
抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑,，尿素等均無(wú)影響

考馬斯亮蘭法

bradford

原理

考馬斯亮藍(lán)（CBB)測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種,。考馬斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色,，最大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?/span>蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm 波長(zhǎng)下有最大光吸收,。其光吸收值與蛋白質(zhì)含

量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定,。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡,，完成反應(yīng)十分迅速;其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡(jiǎn)單,，操作簡(jiǎn)便快捷,，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比 Lowry法還高4倍,，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量,，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0~1 000ug/ml ,是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。

優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度高,，據(jù)估計(jì)比 Lowry 法約高四倍,，蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1ug。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,，蛋白質(zhì)–染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry 法要大的多,。
測(cè)定快速、簡(jiǎn)便,，只需加一種試劑,。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右,。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程,，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,，且在5分鐘至20分鐘之間,，顏色的穩(wěn)定性最好,。因而*不用像Lowry 法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。
干擾物質(zhì)少,。如干擾 Lowry 法的K+,、Na+、Mg2+離子,、Tris緩沖液,、糖和蔗糖、甘油,、疏基乙醇,、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。

缺點(diǎn)：

由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差,，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用v一球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差,。
仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定,主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、Triton x-100,、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH,。(如同0.1N 的酸干擾 Lowary法一樣)
標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算,，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度,。

紫外分光光度法測(cè)定

bradford

原理

蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性質(zhì),，其吸收高峰在280nm波長(zhǎng)處,，在最大吸收波長(zhǎng)處，吸收光度與蛋白質(zhì)溶液濃度的關(guān)系服從朗伯-比爾定律,，故可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù),。

優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、靈敏,、快速,、高選擇性，且穩(wěn)定性好,，不消耗樣品,，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定。

缺點(diǎn)：儀器昂貴,，而且不同的蛋白質(zhì)的紫外吸收是不相同的,，測(cè)定結(jié)果存在著一定的誤差，受光源,、溶液的PH值,、比色皿材質(zhì),、緩沖介質(zhì)溶液等因素的影響和限制。

Lowary蛋白定量法

Lowary

原理

Lowary法是雙縮脲法和福林酚法的結(jié)合與發(fā)展,，其原理是：蛋白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理,，形成銅-蛋白質(zhì)的絡(luò)合鹽，在加入酚試劑后,，除使肽鏈中酪氨酸,、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵,、堿性銅的顯色效果更強(qiáng)烈,。因此，Lowary法的顯色效果比單獨(dú)使用酚試劑強(qiáng)烈3-15倍,，為雙縮脲法的100倍,。由于肽鍵顯色效果增強(qiáng)，從而減小了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差,。

優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：微克級(jí)高靈敏度定量測(cè)定,，穩(wěn)定。

缺點(diǎn)：

受植物體內(nèi)存在的酚類物質(zhì)干擾,。
去污劑如TritonX-100,，SDS，NP-40的濃度超過(guò)0.2%時(shí)會(huì)影響定量結(jié)果,。

上手蛋白定量實(shí)驗(yàn),，我們有招兒

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