技術(shù)指南 | 瓊脂糖凝膠電泳詳解

時間：2021/10/26閱讀：6668

電泳的發(fā)展簡史

1809

國外物理學(xué)家Рейсе發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象

1909

將膠體離子在電場中的移動稱為電泳

1937

創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法，并證明了血清是由白蛋白及α,、β,、γ球蛋白組成的,。

1948

Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法,，對氨基酸的分離進(jìn)行過研究,。

1950

Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后,，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)(如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜,、瓊脂凝膠,、淀粉凝膠等)作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。

1959

Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì),，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳,，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代,。

電泳的基本原理

電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程,。許多重要的生物分子，如氨基酸,、多肽,、蛋白質(zhì)、核苷酸,、核酸等都具有可電離基團(tuán),，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場的作用下,，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動,。電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下,，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異,，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù),。

瓊脂糖凝膠電泳

1.瓊脂糖凝膠電泳原理:瓊脂糖凝膠具絡(luò),物質(zhì)分子通過時到阻力,，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中,，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量,，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力,。但由于其孔徑相比于蛋白質(zhì)太大,，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中,。瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法,。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:心兼有“分子篩"和“電泳"的雙重作用。

2.瓊脂糖凝膠電泳用途:用于DNA切膠回收,；用于DNA分離,；用于佐證DNA是否重組、質(zhì)粒是否切開以及其他分子生物學(xué)研究

3.瓊脂糖凝膠電泳特點：

I,、優(yōu)點：

因不含硫酸根和羧基,，幾乎消除了瓊脂的電滲
對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象,。
凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大,，可用來分離酶的復(fù)合物,、核酸、病毒等大分子物質(zhì),。
透明度較好,，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。
不吸收紫外光,，可直接利用紫外光吸收法作定量測定
有熱可逆性

II,、缺點：

機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎,，濃度不能太低,。
易被細(xì)菌污染，不易保存,，臨用前配制,。
瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散,，電泳后必須立即固定染色。
與PAGE相比,，分子篩作用小,，區(qū)帶少。

瓊脂糖凝膠電泳操作步驟

配膠

1.制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用70ml,小膠用50ml):稱取0.7 g(0.5 g)瓊脂糖置于錐形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小燒杯.微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化,搖勻,，即成1.0%瓊脂糖凝膠液.

制膠板

取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈,晾干,放入制膠玻璃板.取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好,形成模子.將內(nèi)槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層.室溫下靜置直至凝膠*疑固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中.添加

加樣

在點樣板或pa rafi lm上混合DNA樣品和上樣緩沖液,上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X.用10ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi),每加完一個樣品,應(yīng)更換一個加樣頭,以防污染,加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面.(注意:加樣前要先記下加樣的順序).

電泳

加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳,電壓60-100V,樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動.電壓升高,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低.當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約1cm處時,停止電泳.

影響瓊脂糖凝膠電泳因素

DNA分子的大小
凝膠的濃度
DNA的構(gòu)象
使用的電壓
瓊脂糖的種類
電泳緩沖液
嵌入染料的存在

以上這些因素都會對電泳產(chǎn)生影響，具體詳細(xì)內(nèi)容就不在這里給大家一一介紹了,，以后大家遇到什么問題的話,，都可以從這幾方面入手去找問題

技術(shù)指南 | 瓊脂糖凝膠電泳詳解

會員登錄

收藏該商鋪

提示