單克隆抗體的克隆化方法

  克隆的時間一般說來越早越好。因為在這個時期各種雜交瘤細胞同時旺盛生長，互相爭奪營養(yǎng)和空間，而產(chǎn)生抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時間也不宜太早，太早細胞性狀不穩(wěn)定,，數(shù)量少也易丟失。
      克隆化的陽性雜交瘤細胞,，經(jīng)過一段時期培養(yǎng)之后,，也還會因為細胞突變或特定染色體的丟失，使部分細胞喪失產(chǎn)生抗體的能力,，所以需要再次或多次克隆化培養(yǎng),。克隆化次數(shù)的多少由分泌能力強弱和抗原的免疫性強弱而決定,。一般說,，免疫性強的抗原克隆次數(shù)可少一些，但至少要3～5次克隆才能穩(wěn)定,。
     克隆化的方法很多,，包括有軟瓊脂克隆化、顯微操作法,、熒光激活分離法及限稀釋法等,。
    
    （一）軟瓊脂克隆化
借助撒在軟瓊脂上單個細胞定位生長，而達到克隆化,，具體操作如下：
1．配2.5％的瓊脂糖30ml,，水浴溶化后，移入45℃水浴中,。
2．將117ml*DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合,，置45℃水浴預(yù)熱。
3．將瓊脂糖與DMEM液混合,，即為含0.5％瓊脂糖的*DMEM液,，并加75×108 脾細胞,。
4．每塊平皿加10ml,，于室溫中凝固。
5．DMEM中的細胞與DMEM—瓊脂1:1混合,，將細胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上,，使其全部覆蓋,。
    6．放入CO2箱飽和濕度，37℃培養(yǎng)10天,。
    7．用PBS配制0.6％瓊脂糖,，于沸水浴溶解后，置45℃,，在保溫情況下取一試管,，迅速加入0.1ml 25％羊紅血球，0.2ml豚鼠補體,，2.7ml 0.6％瓊脂糖,。
    8．用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h,。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍,，可篩選抗羊紅血球Ig。
 
      （二）顯微鏡操作法
    在直徑6cm培養(yǎng)皿中,，加入1ml 1.0×108細胞懸液放置5％CO2飽和濕度,，37℃溫箱中放置30min以上，倒置顯微鏡下,，尋找那些與周圍相距甚遠的單個細胞,，將毛細管口（一頭有直角彎頭毛細管，一頭連接一尺長乳膠管,，用口控制液體進入）水平置放于液面上,，左右微動，直到看見管口,，對準細胞,，吸入毛細管，將管中細胞移到預(yù)先加有2.0×104~5.0×104飼養(yǎng)細胞96孔板內(nèi),，培養(yǎng)后,，即可獲得單個細胞形成的克隆。
 
      （三）熒光激活分離法
用一種熒光激活細胞分類器（Fluorescein Activafed Cell Sorter,，F(xiàn)ACS）,。其基本原理是：將細胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個細胞的線形液滴,，在萊塞光激發(fā)下,，熒光素發(fā)射熒光，此信號由光電倍增管接收,，再結(jié)合細胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號,，經(jīng)電腦處理，產(chǎn)生信號并與預(yù)定的信號對比,，根據(jù)細胞熒光強度及細胞大小不同,，將細胞分成不同級別,，在電場中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中,。
 
     
      （四）有限稀釋法
1．材料
（1）微量培養(yǎng)盤,，盤內(nèi)各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細胞（即飼養(yǎng)細胞）每孔2萬～4萬。
（2）HT培養(yǎng)基
2．操作方法
（1）取出抗體陽性孔細胞,，用HT培養(yǎng)液制成細胞懸液,。并取樣進行臺盼蘭染色，計數(shù),。
（2）用HT培養(yǎng)液將細胞稀釋成200個/ml,、40個/ml、20個/ml和的懸液,。
（3）用吸管將細胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤,，每孔0.05ml，細胞含量分別為10個/孔,、2個/孔,、1個/孔和0.5個/孔。
（4）5％CO2飽和濕度,，37℃培養(yǎng),。
（5）每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況，選擇只有一個集落生長的孔,，棄掉兩個以上和沒有細胞生長的孔,。
（6）克隆大量繁殖后，布滿孔底的1/3～1/2時,，測培養(yǎng)液抗體,。
（7）抗體陽性孔細胞，移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中,，并傳2～4代就可以脫離飼養(yǎng)細胞,，建成克隆株。