Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation

Keywords: anti-inflammatory phenotype; inhibition, mechanical loading; macrophage polarization; mitogen-activated protein kinase (MAPK); pro-inflammatory (M1) macrophages; three-dimensional (3D) collagen matrix; transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4).

巨噬細胞是一種高度動態(tài)的細胞，參與宿主防御,、組織維穩(wěn)和炎癥消退,。解決炎癥和促進組織再生的療法通常以巨噬細胞為靶點,，通過各種刺激阻斷促炎（M1）激活通路，并調(diào)節(jié)其向抗炎（M2）表型分化,。

巨噬細胞具有高度的機械敏感性,，它們可以感知并響應微環(huán)境中的機械刺激。機械刺激,，包括拉伸,、壓縮和間質(zhì)流動，會影響巨噬細胞極化,，從而驅(qū)動促炎和抗炎表型之間的轉(zhuǎn)換,。巨噬細胞中的機械轉(zhuǎn)導涉及機械傳感器（如粘附分子、細胞骨架成分和離子通道,，包括瞬時受體電位香草醛4（TRPV4）通道）的復雜相互作用,。

TRPV4 是一種機械敏感離子通道，可由機械刺激,、溫度,、化學試劑以及內(nèi)源性或外源性配體激活。TRPV4 激活會誘導構(gòu)象變化,，從而導致 Ca2+ 內(nèi)流,，這在調(diào)節(jié)巨噬細胞行為和炎癥中至關(guān)重要。TRPV4 的藥理學抑制已被證明可以減輕促炎反應,。然而,，尚未研究 TRPV4 抑制和機械負荷對 3D 環(huán)境中巨噬細胞極化的并發(fā)影響。

為此,，美國托萊多大學生物工程系,、生物科學系團隊在最近的一項研究中旨在探索不同機械應變和 TRPV4 抑制劑對 3D 膠原蛋白基質(zhì)中包埋的促炎巨噬細胞的協(xié)同作用,。通過在基因和蛋白質(zhì)水平上評估巨噬細胞表型變化和相關(guān)的機械轉(zhuǎn)導途徑,，揭示了 TRPV4 抑制和機械負荷如何調(diào)節(jié)巨噬細胞的行為，為炎癥消退和組織再生提供潛在的治療見解,。研究成果發(fā)表于 Frontiers in Immunology 期刊題為“Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation",。

首先，為了研究 TRPV4 抑制和/或機械應變（0,、3% 和 6%,，0.1 Hz）下 TRPV4 表達的變化，用抗-TRPV4 抗體標記 TRPV4 離子通道,?？?/span>-TRPV4 抗體染色圖像及其定量表明，在不存在抑制劑的情況下,，TRPV4 表達隨著機械應變幅度增加（0%-6%）逐漸增加,。然而,，在 TRPV4 抑制劑存在的情況下，3% 和 6% 機械應變處理后TRPV4 表達降低,，且在 6% 機械負荷組中降低更多,。

進一步觀察膠原蛋白內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化、密度和內(nèi)部的降解,。Masson 三色染色顯示機械應變和TRPV4抑制劑處理后膠原密度的變化（圖1 A）,，B-CHP 染色可視化和量化膠原蛋白的降解（圖1 B、C）,。

圖1 A 顯示,，與對照組（TRPV4（0）-0%）相比，暴露于不含 TRPV4 抑制劑的 3% 機械應變的 M1 巨噬細胞（TRPV4（0）-3% ）組表現(xiàn)出松散的膠原纖維結(jié)構(gòu),。在 TRPV4（0）-3% 組中觀察到的低膠原蛋白含量被 TRPV4 抑制劑部分補償,。總體而言,，與 TRPV4（0）組相比,，TRPV4 抑制劑（TRPV4（-）組）處理的 M1 巨噬細胞的膠原纖維更厚。這表明阻斷 M1 巨噬細胞中的 TRPV4 通道可能通過阻止膠原蛋白降解和調(diào)節(jié)巨噬細胞表型來提高膠原蛋白密度,。

圖1 B,、C顯示，高水平的降解發(fā)生在沒有 TRPV4 抑制劑的 3% 機械應變組（TRPV4（0）-3%）中,，與 Masson 三色染色的觀察結(jié)果一致,。雖然有或沒有 TRPV4 抑制劑的 0% 機械應變組之間的降解膠原蛋白略有不同，但在 3% 和 6% 機械應變基質(zhì)中添加 TRPV4 抑制劑導致膠原蛋白變性和降解程度降低（圖1 B）,。

圖1    （A）用 Masson 三色染色的膠原纖維（藍色）和細胞核（紫色）的組織學圖像,。（B）用 B-CH 染色的 3D 基質(zhì)中降解的膠原纖維的熒光圖像。（C）圖像分析中降解膠原蛋白的定量,。

膠原纖維密度和降解數(shù)據(jù)的變化表明,，在 TRPV4 抑制和機械應變應用后，巨噬細胞存在表型變化,。接下來,，實驗旨在驗證應用于負載巨噬細胞的 3D 組織基質(zhì)的 TRPV4 抑制劑和/或機械負荷是否在細胞內(nèi)水平上產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)效應。使用 ELISA 評估絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的關(guān)鍵成分 ERK1/2 和 p38 MAPKs,。正如巨噬細胞機械轉(zhuǎn)導通路（圖2 A）所示,，響應 TRPV4 抑制和機械應變，蛋白激酶C（PKC）被激活,，進一步下游傳導到 MAPK,、ERK1/2 和 p38 MAPKs，并觸發(fā)炎癥反應和促炎細胞因子和趨化因子的表達,。

圖2 B 顯示,，機械應變和 TRPV4 抑制劑在不同條件下影響 p38 MAPK 表達,。在沒有機械應變（0%）的情況下，p38 MAPK 表達在 TRPV4（0）和 TRPV4 抑制組（TRPV4（-））之間沒有顯著變化,。在 3% 的機械應變下,，p38 MAPK 表達顯著降低至 133.53 pg/ml。在 6% 的機械應變下,，TRPV4（0）組 p38 MAPK 表達顯著下調(diào)至 138.53 pg/ml,，（TRPV4（-））組顯著下調(diào)至 149.42 pg/ml。

圖2 C 顯示了每組中與 ERK1/ERK2 蛋白表達相關(guān)的吸光度,。在沒有機械應變（0%）的情況下,，ERK1/2 表達在 TRPV4（0）和 TRPV4 抑制組（TRPV4（-））之間沒有顯著變化。同樣,，在 3% 的機械應變下,，即使 TRPV4 抑制，ERK1/2 的表達也沒有顯著變化,。然而,，在 6% 機械應變下，與無機械應變（0%）組相比,，TRPV4（0）組的 ERK1/2 表達顯著下調(diào)至 0.22AU,，TRPV4（-） 組的顯著下調(diào)至 0.21AU。

這些數(shù)據(jù)表明,，TRPV4 抑制和機械應變聯(lián)合調(diào)節(jié)巨噬細胞 MAPK 信號通路,。

圖2    TRPV4 抑制和機械加載后激活的機械轉(zhuǎn)導途徑。（B）p38 MAPK 濃度的變化,。（C）ERK1/ERK2 合成,。

最后，在確認關(guān)鍵通路受 TRPV4 抑制和機械負荷調(diào)節(jié)后,，使用基因表達分析研究了 P38 和 ERK1/2 通路調(diào)節(jié)導致的巨噬細胞表型變化,。評估重要促炎標志物（IL-1b、TNF-a,、COX2 ）,、抗炎標志物（CD163,、CCL18）和基質(zhì)降解標志物（MMP13）的表達（圖3）,。

關(guān)于炎癥標志物（圖3 A ），數(shù)據(jù)表明,，TRPV4 抑制和機械負荷對IL-1β 表達的影響取決于應變幅度,。在無機械負荷下，TRPV4（-）和 TRPV4（0）組之間的 IL-1β 水平?jīng)]有顯著變化,。當機械應變?yōu)?3% 時,，TRPV4（0）組的 IL-1β 表達比無應變組增加了近 5 倍,，然而，TRPV4（-）組 IL-1β  表達顯著降低,。這表明 TRPV4 抑制可以抵消 3% 機械應變時 IL-1β 表達的上調(diào),。當機械應變?yōu)?6% 時，無論 TRPV4 抑制如何,，所有組的 IL-1β 表達均顯著降低,。與 TRPV4（0）組的無機械負荷相比，3% 機械應變下 TNF-α 表達顯著增加約 5 倍,，然而,，TRPV4（-）組在 3% 機械應變下 TNF-α 表達顯著減弱。在 6% 機械應變下,，雖然 TRPV4（0）組的 TNF-α 表達與 TRPV4（0）-0% 組相比沒有顯著變化,，但在 TRPV4 抑制下，TNF-α表達與 TRPV4（0）-0% 和 TRPV4（0）-6% 組相比均顯著降低,。與 TRPV4（0）-0% 組相比,，TRPV4（0）組 3% 和 6% 機械負荷的 COX2 表達分別增加了 2.39 倍和 4.88 倍。TRPV4（-）組 3% 和 6% 的機械負荷的 COX2 表達顯著降低,。MMP13 基因表達數(shù)據(jù)還表明,，與 TRPV4（0）-0 組相比，TRPV4（0）組在 3% 應變時MMP13 表達顯著增加,。然而,，在 TRPV4（-）組 3% 機械應變下，MMP13 表達顯著降低,。在 6% 機械應變時,，與有和沒有 TRPV4 抑制的 0% 和 3% 機械應變組相比，MMP13 表達在有和沒有 TRPV4 抑制的情況下進一步降低,。

關(guān)于抗炎標志物,，在 TRPV4 抑制后，0% 機械應變組的 CD163 表達沒有顯著變化,。在 3% 機械應變時,，與 TRPV4（0）-0% 組相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CD163 表達顯著降低,。在 6% 機械應變時,，與 0% 和 3% 機械應變組相比，TRPV4（0）組的 CD163 表達顯著增加,。在 TRPV4 抑制且 6% 機械應變后,，CD163 表達與TRPV4（0）組相比降低。在 TRPV4 抑制后，0% 機械應變組的 CCL18 表達也沒有顯著變化,。在 3% 機械應變時,，與 TRPV4（0）-0% 組相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CCL18 表達降低,。在 6% 機械應變時,，與 0% 和 3% 機械應變組相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CCL18 表達增加,。然而,，在 3% 和 6% 機械負荷組內(nèi)，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CCL18 表達差異無統(tǒng)計學意義,。

熱圖（圖3 B）直觀地顯示了 TRPV4 抑制劑和/或各種機械應變應用后促炎和抗炎基因表達的總體變化,。熱圖表明，TRPV4 抑制在 3% 和 6% 的機械應變下顯著降低了促炎基因的表達,。具體來說,，TRPV4 抑制與 6% 的機械應變協(xié)同促進抗炎巨噬細胞表型變化。

圖3   （A）TRPV4 抑制劑和機械應變對 3D 膠原蛋白基質(zhì)內(nèi)巨噬細胞促炎和抗炎標志物以及基質(zhì)降解標志物表達的影響,。（B）TRPV4 抑制劑和/或各種機械加載應用后促炎和抗炎基因表達的熱圖,。

雖然基因表達數(shù)據(jù)可能表明在 mRNA 水平上表型向 M1 或 M2 表型轉(zhuǎn)變，但在沒有蛋白質(zhì)水平確認的情況下,，仍不確定基因水平的變化是否轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)水平并確認巨噬細胞極化,。因此，免疫組化用于可視化靶向促炎巨噬細胞標志物 CD80 和抗炎巨噬細胞標志物 CD206 的表面抗體的結(jié)合,。除了促炎和抗炎表面抗體外,，細胞核和絲狀肌動蛋白（F-actin）也分別使用 DAPI 和鬼筆環(huán)肽進行標記。將巨噬細胞暴露于有或沒有 TRPV4 抑制劑的各種機械應變幅度下,，圖4 顯示了 3D 膠原蛋白基質(zhì)中巨噬細胞的細胞核,、促炎和抗炎標志物以及巨噬細胞 F-肌動蛋白的共聚焦圖像。

抗炎標志物 CD206 在 0% 機械應變和 3% 機械應變組中在 TRPV4 抑制后上調(diào),。與沒有 TRPV4 抑制的各自對照相比,，TRPV4（-）-0% 和 TRPV4（-）-3% 組中 CD206 表達增加可以明顯證明這一點。相比之下,，促炎標志物 CD80 在這些情況下下調(diào),，表明向抗炎表型轉(zhuǎn)變。此外,，當 3D 膠原蛋白基質(zhì)中的巨噬細胞承受 6% 的機械應變時,，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CD206 表達顯著增加，突出了 6% 機械應變的抗炎作用,。

圖4     用 DAPI,、F-肌動蛋白和鬼筆環(huán)肽、促炎（CD80）和抗炎標志物（CD206）染色的細胞核的共聚焦顯微鏡圖像,。

這項研究為 TRPV4 抑制和機械負荷對 3D 膠原蛋白基質(zhì)中巨噬細胞極化和 ECM 重塑之間的復雜相互作用提供了新的見解,。結(jié)果表明，機械負荷,，尤其是與 TRPV4 抑制結(jié)合時,，可顯著調(diào)節(jié)巨噬細胞表型并影響膠原蛋白完整性，從而突出了 TRPV4 在機械轉(zhuǎn)導和炎癥中的關(guān)鍵作用,。這些結(jié)果對于在炎癥和基質(zhì)降解是關(guān)鍵問題的機械動態(tài)組織和疾病中開發(fā)靶向抗炎療法具有重要意義,。

參考文獻：Babaniamansour P, Jacho D, Rabino A, Garcia-Mata R, Yildirim-Ayan E. Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation. Front Immunol. 2025 Jan 7;15:1456042. doi: 10.3389/fimmu.2024.1456042. PMID: 39850885; PMCID: PMC11756524.

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