Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling

Keywords: Cancer-associated fibroblasts; Colorectal cancer; Fibroblast heterogeneity; NECTIN2; TinCAFs.

結(jié)直腸癌（CRC）是最常見和最致命的癌癥之一,。CRC具有異質(zhì)性腫瘤微環(huán)境,，具有dute的成纖維細(xì)胞群,。腫瘤生長和進(jìn)展的過程與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）有關(guān)。據(jù)報道,，CAF調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的募集,，并影響血管生成、腫瘤干性和耐藥性,。因此,，CAF在很大程度上促進(jìn)了癌癥的進(jìn)展，被認(rèn)為是治療的重要靶點,。

盡管在胰腺導(dǎo)管腺癌,、乳腺癌和肺癌中對CAF的表征方面取得了進(jìn)展，但仍缺乏對結(jié)直腸癌CAF的全面分析,。研究已經(jīng)報道了兩種主要的CAF亞型,，它們要么表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分子和調(diào)節(jié)劑（稱為CAF-A），要么表達(dá)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物（稱為CAF-B）,。此外,，CRC CAF特征與預(yù)后不良相關(guān)。然而,，由于以往的研究主要集中在分析CRC的整體細(xì)胞組成上,，因此對CAF亞型的廣泛分析受到測序CAF數(shù)量相對較少的阻礙。CAF在CRC中起著核心作用,，目前仍缺乏對CAF異質(zhì)性的全面分析,。

最近，在德國哥廷根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的一項研究中,，通過結(jié)合單細(xì)胞RNA測序（scRNA seq）和空間蛋白質(zhì)組學(xué),，對人類結(jié)腸和CRC組織樣本中的成纖維細(xì)胞異質(zhì)性進(jìn)行了深入分析，發(fā)現(xiàn)并命名了一種新的亞型TinCAF,，證明了 TinCAF 特征標(biāo)志物的高表達(dá)與 CRC 患者的無復(fù)發(fā)生存期縮短有關(guān),。這種新發(fā)現(xiàn)的CAF可能代表了未來CRC免疫療法的潛在靶點。研究成果發(fā)表在 Cancer Letters 期刊題為“Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling",。

首先,，研究人員全面分析了成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，通過對8個不同樣本（6個CRC樣本,，2個正常結(jié)腸樣本）進(jìn)行scRNA-seq（圖1 A,、B），發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞聚集成了11個不同的簇（圖1 C）,。有趣的是,，大多數(shù)簇在正常樣本和CRC組織中都被發(fā)現(xiàn)（圖1 D），然而，簇3,、5,、7 和 9 幾乎只存在于 CRC 組織中，因此代表了 CAF 特異性簇,。

基于對差異表達(dá)標(biāo)記基因的分析,，已知的成纖維細(xì)胞亞型，如apCAF（簇1）,、“上皮維持"成纖維細(xì)胞（簇2）,、myCAF（簇3）和 iCAF（簇7）被鑒定出來（圖1 E）。簇9 顯示 MKI67,、CENPF,、CDK1 和其他細(xì)胞周期相關(guān)基因的高表達(dá)，表明該簇為增殖成纖維細(xì)胞的區(qū)室,。簇5 不表達(dá)已知的 CAF 特征標(biāo)記物,，但顯示出免疫相關(guān)基因的表達(dá)，如CD40,、CD276和NECTIN2（圖1 E）,。這證明了人類正常結(jié)腸組織和CRC組織中的成纖維細(xì)胞異質(zhì)性，揭示了已知的CAF亞型,，但鑒定了一種新的CAF簇。

為了進(jìn)一步分析簇5 及其潛在的功能特征,，利用基因集富集分析（GSEA）,，發(fā)現(xiàn)其中富集的基因集與干擾素反應(yīng)和氧化磷酸化相關(guān)，表明這些 CAF 具有免疫反應(yīng)和代謝活性（圖 1 F）,。進(jìn)一步評估差異表達(dá)基因,，注意到與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的其他基因，如 CD39,、CD59,、CAV1、MIF 和 Notch3（圖1 G）,。這些數(shù)據(jù)說明,，簇5 成纖維細(xì)胞與癌癥相關(guān)，但與已知的 CAF 亞群不同,，并顯示出免疫調(diào)節(jié)基因表達(dá)譜,。

當(dāng)比較同一患者CRC 成纖維細(xì)胞和正常組織中簇-特征標(biāo)志物的蛋白質(zhì)表達(dá)水平時，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá),，證實了成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性和蛋白質(zhì)組學(xué)水平上的 CAF 特異性特征,。由于新發(fā)現(xiàn)的簇5 特別令人感興趣，研究人員更仔細(xì)地分析了簇5 蛋白標(biāo)記物NECTIN2（CD112）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NECTIN2表達(dá)僅在腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn),，主要與表達(dá)CD90的成纖維細(xì)胞亞群共定位,，但不在上皮腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。

圖1     結(jié)直腸癌和結(jié)腸成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性,。

由于簇5 與免疫細(xì)胞和 T 細(xì)胞相互作用性狀相關(guān),，因此，實驗接下來分析了 CAF 標(biāo)記蛋白與 T 細(xì)胞相關(guān)的表達(dá)模式,。結(jié)果表明,，所有CAF相關(guān)標(biāo)志物在接近T細(xì)胞的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著升高。這些發(fā)現(xiàn)指出了T細(xì)胞和CAF之間的密切相互作用,，并暗示了T細(xì)胞可能影響TME中某些CAF的募集和分布的可能性,。

空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，CAF和腫瘤浸潤性T細(xì)胞之間存在密切的相互作用,。因此,，使用共培養(yǎng)試驗評估了結(jié)直腸癌衍生的 CAF 對 T 細(xì)胞的影響。首先,，使用流式細(xì)胞術(shù)在不同患者的原代CAF培養(yǎng)物中檢測到簇5 CAF的6個特征蛋白標(biāo)記物（圖2 A,、B），并證實了共表達(dá)（圖2 C）,，表明簇5 CAF的表型在原代培養(yǎng)物中得以維持,。

然后將原代 CAF 與 T 細(xì)胞共培養(yǎng)三天以表征 CAF 和 T 細(xì)胞之間的相互作用（圖2 D）。盡管在整個共培養(yǎng)過程中不斷刺激 T 細(xì)胞,，但 CAF 顯著降低了 T 細(xì)胞活力和增殖,，證明了 CRC CAF 對 T 細(xì)胞的抑制特性（圖2 E）。CD4 輔助性T 細(xì)胞顯示 CD69 和 TIM-3 表達(dá)增加,，其他測試標(biāo)志物沒有顯示出明顯的趨勢（圖2 F）,。在 CD8 細(xì)胞毒性T 細(xì)胞中，CD69 和 TIM-3 在 CAF 存在下也顯著上調(diào),。然而,，CD25、CD137 和 PD-1 顯著下調(diào)（圖2 F）,。這些數(shù)據(jù)表明,，CAF可以在體外破壞T細(xì)胞的活化并抑制其增殖。

此外,，分析了共培養(yǎng)后的 CAF 表型以評估直接 T 細(xì)胞相互作用引起的可能調(diào)節(jié),。值得注意的是，CAF 在共培養(yǎng)的三天內(nèi)顯著上調(diào)了 VCAM1 以及簇5 特異性 CAF 蛋白標(biāo)記物 NECTIN2 和 CD40（圖2 G）,，表明 T 細(xì)胞可以直接調(diào)節(jié) CAF 的表型,，正如空間蛋白質(zhì)組學(xué)所揭示的那樣,。CD40 是 T 細(xì)胞活化標(biāo)志物 CD154（CD40L）的受體，而 NECTIN2 可以結(jié)合 T 細(xì)胞表達(dá)的多種受體,，表明簇5 CAF 直接參與 CRC 中 T 細(xì)胞反應(yīng)的協(xié)調(diào),。

圖2     CAF-T細(xì)胞相互作用的功能分析。

實驗假設(shè) CRC CAF 可以通過上調(diào)簇5 蛋白標(biāo)志物 NECTIN2 和 CD40 來抑制 T 細(xì)胞增殖和活化,。為了研究這些標(biāo)記物的作用,，在共培養(yǎng)實驗中應(yīng)用了阻斷受體-配體結(jié)合的功能性抗體。在T細(xì)胞激活后,，大多數(shù)T細(xì)胞獲得了效應(yīng)記憶或效應(yīng)記憶重新表達(dá) CD45RA 表型,，而只有 20-30% 的 T 細(xì)胞表現(xiàn)出幼稚表型（圖3 A）。與CAF的直接相互作用顯著降低了T⁺ _EM 的豐度和 T_EMRA 細(xì)胞,，而大約 60-80% 的 T 細(xì)胞保留在幼稚 T 細(xì)胞狀態(tài),。此外，在抗體介導(dǎo)的阻斷是NECTIN2而不是CD40時,，CAF的抑制作用被wanquan消除,。

對與CAF共培養(yǎng)的T細(xì)胞的活化和損耗標(biāo)志物表達(dá)的分析顯示出異常表型（圖3 B）：與單獨使用T細(xì)胞相比，活化和耗竭標(biāo)志物均增加,。相比之下,，CD40 和更明顯的NECTIN2阻斷顯著降低了 CD25、TIM-3,、LAG3 和 PD1 的表達(dá),，表明這兩種 CAF 標(biāo)志物都是抑制作用所必需的。在CD8 T細(xì)胞中,，NECTIN2阻斷的作用更為明顯,，表明NECTIN2是CD8 T細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。雖然阻斷NECTIN2對T細(xì)胞活化和分化有顯著影響,，但NECTIN2受體的表達(dá)不受影響，這表明對T細(xì)胞的影響確實主要由NECTIN2介導(dǎo),。

最后,，為了研究簇5 CAF特異性基因表達(dá)的臨床相關(guān)性，研究人員在1342例結(jié)腸癌患者的公開臨床數(shù)據(jù)庫中評估了NECTIN2,、CD40和CD248的表達(dá),，發(fā)現(xiàn)NECTIN2高表達(dá)患者的預(yù)后明顯差于低NECTIN2表達(dá)的患者。同樣,，CD40 或CD248的高表達(dá)也是該患者隊列中的不良預(yù)后因素,。此外，NECTIN2,、CD40 和 CD248 的高表達(dá)僅在 158 例微衛(wèi)星穩(wěn)定型（MSS）患者中與無復(fù)發(fā)生存期（RFS）的顯著降低相關(guān),，而在微衛(wèi)星不穩(wěn)定型（MSI）高表達(dá)患者中不相關(guān),。

鑒于簇5  CAF 標(biāo)志物NECTIN2的顯著預(yù)后價值，實驗測試了其表達(dá)與其他腫瘤實體臨床結(jié)果的相關(guān)性,，結(jié)果證實了在乳腺癌,、肺腺癌、胃癌以及急性髓系白血病和多發(fā)性骨髓瘤中,，高NECTIN2表達(dá)是患者預(yù)后不良的因素,。這些數(shù)據(jù)強調(diào)了NECTIN2作為免疫治療潛在靶點的臨床相關(guān)性和預(yù)后價值。

圖3    阻斷 CD40 或 NECTIN2 調(diào)節(jié)共培養(yǎng)后的 T 細(xì)胞表型和耗竭,。

圖4    研究對人類結(jié)直腸癌和結(jié)直腸癌患者正常結(jié)腸組織中的成纖維細(xì)胞異質(zhì)性進(jìn)行了全面分析,，確定了11個成纖維細(xì)胞亞群（圖4 a）。其中,，發(fā)現(xiàn)了先前描述的亞群,，例如myCAF-樣，iCAF-樣,，apCAF-樣和“上皮維持"成纖維細(xì)胞,。四個亞群幾乎只存在于 CRC 組織中，因此代表了 CRC CAF,。研究鑒定了一種新的 CAF 亞群,，基于其 T 細(xì)胞抑制和耗竭誘導(dǎo)特征，將其命名為 T 細(xì)胞抑制性 CAF（TinCAF）（圖4 b）,。

綜上所述,，該研究認(rèn)為這種新型NECTIN2-陽性CAF亞型是抑制TME的重要參與者，也是下一代免疫檢查點抑制劑的潛在新靶點,。這些抑制劑可能是一個有價值的選擇,，特別是在MSS腫瘤中。

參考文獻(xiàn)：Agorku DJ, Bosio A, Alves F, Str?bel P, Hardt O. Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling. Cancer Lett. 2024 Jul 28;595:216985. doi: 10.1016/j.canlet.2024.216985. Epub 2024 May 29. PMID: 38821255.

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